Генетические изменения мастоцитов и их значение в прогнозе и лечении тучных опухолей

Szymon Zmorzynski, Aleksandra Kimicka-Szajwaj, Angelika Szajwaj, Joanna Czerwik-Marcinkowska and Jacek Wojcierowski

Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10815783/
Перевод: Сергеева Е. С.

 

Абстракт

Тучные опухоли представляют собой большую группу заболеваний, встречающихся у собак, кошек, мышей, а также у человека. Системный мастоцитоз (СМ) – заболевание, сопровождающееся накоплением тучных клеток в органах. Мутации гена KIT очень часто наблюдаются в аномальных тучных клетках. При СМ наблюдается высокая экспрессия KIT/CD117; однако мутаций гена KIT обычно не наблюдается. Мастоцитома (МСТ) — форма кожного новообразования — часто встречается у животных, но довольно редко у людей. Мутации рецептора KIT/CD117 изучались как типичные изменения при мастоцитозе человека. В 80% случаев у людей присутствовала замена гена KIT p.D816H. Примерно в 25% случаев МСТ наблюдалось метастазирование. Изменения в экспрессии определенных генов, такие как сверхэкспрессия гена DNAJ3A3, способствуют метастазированию. Напротив, ген SNORD93 блокирует экспрессию генов метастазирования. Панель миР-21-5p, миР-379 и миР-885 имеет хорошую эффективность в различении здоровых и пораженных МСТ собак, а также собак, пораженных МСТ, с узловыми метастазами и без них. Дальнейшие исследования патобиологии тучных клеток могут привести к клиническим улучшениям, таким как улучшение диагностики и лечения МСТ. В нашей статье представлен обзор исследований на тему тучных клеток, которые проводились за последние несколько лет.

 

Ключевые слова: мастоциты, тучные клетки, мастоцитоз, мастоцитома, мутации, гены, микроРНК.

 

Введение

Тучные опухоли представляют собой большую группу заболеваний, встречающихся у собак, кошек, мышей, а также у человека. Это могут быть относительно доброкачественные или злокачественные опухоли. Прогноз в доброкачественных случаях может быть несколько приближенным, тогда как в злокачественных прогноз довольно неблагоприятный. Форма кожной тучноклеточной опухоли — мастоцитома — особенно распространена у собак. Он составляет 16–21% всех опухолей кожи собак. [1,2].

 

Характеристики мастоцитов

Тучные клетки (ТК) были впервые идентифицированы Паулем Эрлихом в 1878 году [3]. ТК представляют собой сферические клетки в цитоплазме, содержащие значительное количество секреторных гранул. Клетки, сходные с тучными клетками, представляют собой базофилы, размеры которых немного меньше ТК (8 мкм); в их цитоплазме меньше гранул; их гранулы не содержат триптазы; их клеточная мембрана не имеет рецептора KIT, но содержит рецептор FcεR1. Предшественники базофилов созревают в костном мозге под влиянием ИЛ-3 [4]. Гранулы метахроматически окрашиваются толуидиновым синим, сафранином или сульфатом берберина. Функция ТК, по мнению Эрлиха, изначально была связана с системой питания тканей (отсюда и название «тучные клетки»). После обнаружения высвобождения гепарина и гистамина из ТК при анафилактическом шоке [5] было обнаружено, что тучные клетки играют роль в реакциях гиперчувствительности I типа (аллергии) [6]. ТК играют роль в регуляции аллергических и воспалительных процессов, секретируют медиаторы как врожденного, так и приобретенного иммунитета [7], играют роль в поддержании иммунного гомеостаза [8] и играют роль в процессах заживления ран [9,10]. ТК вместе с дендритными клетками (ДК) и моноцитами являются первыми клетками иммунной системы, взаимодействующими с чужеродными антигенами. После соответствующей стимуляции ТК могут повторно войти в клеточный цикл и пролиферировать. Повышенное рекрутирование и локальное созревание предшественников тучных клеток также может способствовать увеличению популяции MC в тканях [11]. Во время индивидуальных биологических реакций ТК могут функционировать как эффекторные клетки, иммунорегуляторные клетки или и то, и другое [12]. Эффекторные функции МК связаны с (I) удалением патогенов посредством фагоцитоза и/или секреции антимикробных белков; (II) деградация токсичных эндогенных пептидов и компонентов яда; (III) повышенная проницаемость сосудов (например, за счет секреции гистамина); (IV) стимуляция сокращения гладкомышечных клеток бронхов (например, с помощью лейкотриена C4); (V) стимуляция синтеза коллагена фибробластами (например, посредством триптазы) [12].

Гранулы тучных клеток содержат такие факторы и вещества, как полиамины, амины (серотонин, дофамин и гистамин), ферменты (катепсины, β-гексозаминидаза, арилсульфатаза, гепараназа, каспаза, ангиогенин и калликреины), протеазы (металлопротеиназы, химаза, гранзим B, карбоксипептидаза А, триптаза), протеогликаны (гепарин, серглицин и хондроитинсульфат), цитокины (TNF-α, TNF-γ, β-FGF, Il-4, SCF и большинство интерлейкинов), хемокины (CCL2, CCL5, CCL7, CCL11 и MCP4), пептиды (эндорфин, эндотелин, кателицидин и VIP), метаболиты (простагландины D2, E2, лейкотриены и PAF) и факторы роста (SCF, GM-CSF, β-FGF, NGF, PDGF, TGF-β и VEGF). Подробное описание этих факторов и литературу по их открытию также можно найти в превосходных обзорных статьях, авторами которых являются de Silva et al., 2014 и Moon et al., 2014 [13,14]. Следует также добавить, что содержание гранул зависит от ткани, из которой были выделены ТК. Тучные клетки содержат множество медиаторов (как упоминалось выше), таких как гепарин, гистамин, триптаза, химаза, VEGF и TNF-α, которые, высвобождаясь на начальных стадиях заживления ран, влияют на кровотечение с последующей коагуляцией и острым воспаление. Различные дополнительные быстро продуцируемые вазоактивные и хемотаксические медиаторы (C3a, C5a, PAF) способствуют этим процессам, в то время как провоспалительные и стимулирующие рост медиаторы тучных клеток (VEGF, PDGF, TGF-β, NGF, IL-4, IL -8) способствуют неоангиогенезу, фибриногенезу или реэпителизации во время процесса репарации [15].

Секреция веществ, накопленных внутри гранул тучных клеток, происходит путем экзоцитоза. Описано несколько путей трансмембранного переноса [14,16], например:

• анафилактический экзоцитоз (дегрануляция без синтеза de novo), наблюдаемый после лечения пептидами комплемента С3а и С5а (на рецепторах комплемента), змеиным ядом, УФ, акролеином, наночастицами титана;
• селективный экзоцитоз (дегрануляция) клеточных гранул может возникнуть после действия специфических стимуляторов, в том числе антигена или IgE на FcεR1 (высвобождается гистамин), нейропептидов на NKR (высвобождаются цитокины, хемокины и 5НТ), 48/80 на Mrgprx2 (цитокины и высвобождаются хемокины), кателицидин на рецепторе, связанном с G-белком (GPCR, высвобождение гистамина), дефензины на GPCR (высвобождение гистамина), плевроцидин на GPCR (высвобождение цитокинов и хемокинов), A23187 (высвобождение цитокинов и хемокинов), морфин и кодеин на опиоидном рецепторе (высвобождение цитокинов, хемокинов и гексозаминидазы) и NGF на рецепторе Trk (высвобождение гистамина и PGE2);
• конститутивный экзоцитоз связан с высвобождением гранул без дегрануляции после обработки зимозаном на TLR2 (высвобождение GM-CSF, Il-1β), поли(I-C) на TLR (высвобождение цитокинов), LPS на TLR4 и CD14 (высвобождение цитокинов и хемокинов), SCF на MAPK (высвобождение цитокинов) и лектин на TIM3 (высвобождение цитокинов);
• без дегрануляции и без синтеза de novo (экзоцитоза экзосом). Экзосомы представляют собой везикулы диаметром 30–100 нм, образующиеся в секреторных гранулах. Эти пузырьки проникают через клеточную мембрану, выходят за пределы клетки и после переноса в жидкости организма поглощаются другими клетками. Экзосомы важны для межклеточной коммуникации. Они содержат множество белков, до 1000 различных мРНК и более 100 молекул микроРНК [17,18,19].

 

Биогенез и высвобождение содержимого цитоплазматических гранул требуют присутствия многих белков, включая Munc 13–4  [20], комплексин (синафин) [21], RAB GTPase [22], белок-регулятор лизосомального транспорта (LYST), синаптотагмин [23], гранины, RAC1/2 [24], DOCK3 [25], протеогликаны и рецептор белка чувствительного фактора прикрепления (SNARE) [26].

Происхождение ТК – эффекторных клеток врожденного иммунитета – первоначально связывали исключительно с миелоидным кроветворением. В настоящее время принято считать, что определенное количество ТК происходит из эритроидно-миелоидных предшественников (ЭМП-клеток) желточного мешка [27]. Следующими этапами созревания в костном мозге являются (1) взрослые гемопоэтические стволовые клетки (HemASC); (2) мультипотентный предшественник, содержащий β7-интегрин, Il-33R и активный гликолиз (MPP); (3) общий миелоидный предшественник, содержащий Il-7R, CD27 и активный гликолиз (CMP); (4) гранулоцитарно-макрофагальный предшественник, содержащий CD34, FcγRII и активный гликолиз (GMP); (5) базофил и предшественник MC, содержащий β7-интегрин, CD16/32 и активный гликолиз (B/MCP); (6) незрелый предшественник MC (обладающий CD34, CD45, FcγRII, FcεRI и β7-интегрином, с активным гликолизом); (7) предшественники MC (обладающие CD34, CD45, FcγRII, FcεRI, β7-интегрином, гранулами и гликолизом) (рис. 1). Предшественники MC присутствуют в периферической крови и могут созревать в тканях-мишенях под действием цитокинов, хемокинов и факторов роста [28]. Стадии созревания представлены по данным Mendoza et al., 2021 [29]. Изображения зрелых тучных клеток, полученные с помощью электронной микроскопии, представлены в статье MacDonald et al. [30]. В цитоплазме ТК идентифицировано пять типов морфологически различных гранул: (тип I) электронно-плотное ядро, окруженное редкими частицами; (тип II) менее электронноплотное и более электроннопрозрачное ядро; (тип III) однородный просвет/частицы; (тип IV) смесь электронно-плотных везикул; и (тип V) частицы и свиткообразные или мультиламеллярные везикулы [30].

 

Рисунок 1
Стадии созревания МК. Эритроидно-миелоидные предшественники и взрослые гемопоэтические стволовые клетки не были включены в рисунок. MPP – мультипотентный предшественник; CMP – общий миелоидный предшественник; GMP – предшественник гранулоцитов-макрофагов; B/MCP – предшественник базофила и MC; MCCT – содержит в гранулах триптазу, химазу и CPA; МСТ – в гранулах содержится только триптаза; и MCCPA3, содержащая карбоксипептидазу CPA3 в гранулах.

 

У грызунов описаны два типа ТК: тучные клетки слизистой оболочки (ММК) и тучные клетки соединительной ткани (СТМК). ММК обнаруживаются в эпителии слизистых оболочек легких и желудочно-кишечного тракта. Эти клетки содержат протеазы mMCP1 и mMCP2 (химазы), связанные с хондроитинсульфатом. ЦТМК присутствуют в подслизистой оболочке кишечника, брюшине и коже. Эти клетки содержат химазу mMCP4, триптазы mMCP5 и mMCP6, а также карбоксипептидазу mCPA, связанную с серглициновыми протеогликанами [31,32]. У человека описаны три типа ТК: MCCT, содержащие в гранулах триптазу, химазу и CPA; МСТ, содержащие только триптазу [33,34]; и MCCPA3, содержащий карбоксипептидазу CPA3, но не химазу. МСТ присутствуют в слизистых оболочках кишечника и легких. MCCCT присутствуют в коже, лимфатических узлах и подслизистой оболочке кишечника и легких. MCCPA3 наблюдаются в эпителии легких (при астме) и пищеводе (при эозинофильном воспалении) [35,36]. ТК зрелых тканей являются долгоживущими клетками [37]. Было проведено мало исследований по дифференцировке и фенотипам зрелых ТК у собак.

На поверхности ТК присутствуют специфичные для тучных клеток антигены, например CD16, CD32 и другие белки (табл. 1) [13,38,39,40,41,42,43,44].

Маркет	Тип	Белковая функция
CD16 (FcγRIII, FCGR3A)	Миграция	Рецептор
CD32 (FcγRII, FCGR2)	Миграция	Рецептор
CD34	Миграция, тканеспецифичная	Молекула адгезии
CD63	Активация	Рецептор
ENPP3 (CD203c)	Активация	Рецептор
FCER1 (IgE receptor, FCεRI)	Созревание	Рецептор
ITGA4 (integrin α4, CD49d)	Миграция	Рецептор
ITGB7 (integrin β7)	Созревание, специфичное для ткани	Рецептор
KIT (CD117, c-Kit)	Общий	Рецептор
VCAM1 (CD106)	Миграция, специфичная для ткани	Рецептор

Таблица 1
Маркеры мембран основных клеток MC.

 

Лиганды и рецепторы тучных клеток

ТК реагируют на множество лигандов, которые стимулируют или ингибируют секрецию факторов, хранящихся в их гранулах или синтезируемых de novo. Выделяют два типа дегрануляции: тотальную (анафилактическую) дегрануляцию и фрагментарную дегрануляцию [14]. Кроме того, в ТК (особенно после стимуляции IgE) синтезируются факторы роста, простагландины, эйкозаноиды, хемокины и цитокины [45]. Альтернативно MC могут стимулироваться патоген-ассоциированными молекулярными паттернами (PAMP), действующими на Toll-подобные рецепторы, факторы роста, пептиды комплемента, цитокины и другие факторы. Затем они избирательно продуцируют такие факторы, как TNF-α [46], гистамин [47], протеазы [48], VEGF, PDGF-β, IL-6 [49] и IL-1 [50]. Эти факторы действуют на кровеносные сосуды, на межклеточный матрикс, на Т-клетки, NK-клетки, макрофаги, супрессорные клетки миелоидного происхождения (MDSC) и дендритные клетки [16].

Лиганды MC действуют путем связывания с рецепторами клеточной мембраны. Стимуляция FcεRI IgE является основной причиной аллергической реакции [51]. IgE, связанный с рецептором, распознает различные антигены. Стимуляция FcεRI включает фосфорилирование киназой Fyn домена мотива активации иммунорецептора на основе тирозина (ITAM). Это приводит к связыванию и аутофосфорилированию киназы Syk [52]. Это приводит к многочисленным фосфорилированиям белков, метаболизму липидов, мобилизации ионов кальция и активации факторов транскрипции [53].

Описано несколько типов рецепторов тучных клеток, например, SCF-связывающий рецептор, рецептор PD1/CD279, Siglec-8, член mas-связанного с G-белком рецептора X2, Toll-подобные рецепторы, тимический стромальный лимфопоэтиновый рецептор и АТФ-рецепторы.

KIT является протоонкогеном [54] и кодирует рецепторную тирозинкиназу. Фактор стволовых клеток (SCF) активирует рецептор, и, следовательно, многие внутриклеточные белки фосфорилируются. KIT обеспечивает пролиферацию HemASC, а также выживание и пролиферацию дифференцированных тучных клеток [55], дендритных клеток и NK-клеток [56]. Эозинофилы [57] и особенно клетки головного мозга также демонстрируют высокую экспрессию KIT [58]. Экспрессия KIT зависит от присутствия фактора транскрипции, ассоциированного с микрофтальмией (MITF) и фактора транскрипции Gata2 [59]. При стимуляции SCF KIT димеризуется и подвергается аутофосфорилированию в околомембранном (JM) домене [60], киназном домене и С-концевом домене. Дальнейшая передача сигнала осуществляется через митоген-активируемую протеинкиназу (MAPK), фосфоинозитид-3-киназу (PI3K), фосфолипазу C гамма (PLC-γ) и киназу JAK [61]. Лигандом KIT является фактор стволовых клеток (SCF), имеющий две изоформы: SCF220 и SCF248 [62]. SCF синтезируется стромальными клетками костного мозга, эозинофилами, фибробластами и гладкомышечными клетками [55].

Рецептор PD1/CD279 (белок запрограммированной гибели клеток) активируется лигандами PDL1/CD274 и PDL2/CD273 [63].

Ингибирующий рецептор сиглек-8 представляет собой сиалогезин, родственный CD33. Он был обнаружен в 2000 г. и экспрессируется в ТК (но не в предшественниках ТК), эозинофилах и базофилах. Его лигандами являются сиалилированный кератансульфат, сиаловая кислота и гликаны [64].

Член связанного с mas рецептора X2, связанного с G-белком (MRGPRX, MrgprB2 у мышей), экспрессируется в MC (MCCT у мышей), присутствующих в коже и подкожной клетчатке [65], а также в эозинофилах и базофилах [66]. В клетках MCCT дегрануляция зависит не от FcεRI, а от стимуляции MRGPRX HDP (пептиды для защиты от бактериальной инфекции), катионного полимера C48/80, опиатов или ванкомицина [67]. Бактерии, атакующие кожу, высвобождают молекулы, чувствительные к кворуму (QSM) и пептиды, чувствительные к компетентности (CSP), которые посредством дегрануляции MRGPRX и MCCT вызывают ингибирование роста бактерий [68].

Клетки MC-типа были обнаружены у беспозвоночных, живших более 500 миллионов лет назад [69]. Их гранулы содержали гепарин и гистамин и дегранулировались при стимуляции. Клетки MC беспозвоночных могут представлять собой старейшую «часть» врожденной иммунной системы.

Toll-подобные рецепторы (TLR) связывают патоген-ассоциированные молекулярные структуры (PAMP) и клещей домашней пыли (HDM), которые вызывают воспаление дыхательных путей [70]. Основными лигандами этих рецепторов являются ацилированные липопептиды (связывающиеся с TLR1); пептидогликаны, муцины, гемагглютинины и маннаны (связывающиеся с TLR2); двухцепочечная ДНК (дцДНК) (связывание с TLR3); липополисахарид (LPS), вирус опухоли молочной железы мышей (MMTV) (связывающийся с TLR4); флагеллин (связанный с TLR5); вирусная одноцепочечная РНК (оцРНК) (связывающая с TLR7 и TLR8); CpG-островки ДНК бактерий и вирусов (связывание с TLR8) [71]. При стимуляции TLR тучные клетки вырабатывают интерлейкин-37, который ингибирует воспалительные процессы, димеризуясь под действием триптазы и гепарина. Иль-37 представляет собой лиганд Иль-18R [72]. Мышиные ТК клеток костного мозга павиана (BBMC), тучных клеток перитонеального происхождения (PCDMC), тучных клеток фетальной кожи (FSDMC), стимулированных ЛПС и пептидогликаном (PGN), синтезируют большое количество интерлейкинов, цитокинов, хемокинов, TNF-α, GM-CSF, INF-α и INF-γ (частично в зависимости от стимулированного TLR) [73,74,75].

Рецептор стромального лимфопоэтина тимуса (TSLPR) связывает стромальный лимфопоэтин тимуса (TSLP), который представляет собой алармин, высвобождаемый из респираторных эпителиальных клеток. TSLP играет роль в хроническом воспалении кожи [76]. Другие аларрины включают IL-25 и IL-33 [77]. IL-33 связывает рецептор ST2/lI-lR4 [78] и увеличивает выживаемость «кожных» ТК за счет стимуляции антиапоптотического белка BCL-XL [79].

АТФ-рецепторы P2X4, P2X7 и P2Y1 дегранулируют мышиные ТК при связывании АТФ, а аденозиновые рецепторы А1, А2а, А2b и А3 (связанные с G-белками) располагаются на поверхности ТК легких [80].

Патология тучных клеток характеризуется возникновением дегрануляции. Наиболее известна реакция гиперчувствительности I типа с антителами IgE, которые связывают безвредные антигены и Fc-рецепторы на ТК, вызывая дегрануляцию ТК. Высвобождение медиаторов может приводить к различным эффектам, включая отек, вазодилатацию и бронхоконстрикцию [81].

 

Синдром активации тучных клеток

Синдром активации тучных клеток (MCAS) зависит от чрезмерной секреции медиаторов тучных клеток, среди прочего, после стимуляции IgE [82]. Врожденными причинами MCAS являются системный мастоцитоз (СМ) и наследственная альфа-триптаземия (ХалфаТ). Наследственная альфа-триптаземия обусловлена наличием дополнительных копий — в форме дупликации или амплификации — гена триптазы-альфа (ген TPSAB1) [83,84,85].

MCAS может проявляться симптомами местного заболевания, включая покраснение, зуд, крапивницу и конъюнктивит; легкие симптомы системного заболевания, включая зуд, эритему, легкую гипотензию, легкую одышку и тошноту; симптомы тяжелого системного заболевания, включая эпидермальные волдыри, ангионевротический отек, лихорадку, потливость, тяжелую одышку, рвоту, диарею и коллапс; и симптомы хронических системных заболеваний, включая воспаление атопических тканей, причем симптомы сохраняются в течение длительного периода времени.

MCAS не является злокачественным новообразованием; не происходит накопления большого количества тучных клеток или специфических генных мутаций, хотя у больных астмой наблюдаются врожденные мутации гена IL13 [86].

Тучные клетки также могут независимо стимулироваться IgE через рецептор FcεR1; IgG через рецептор FcγR1 [87]; фактор стволовых клеток (SCF) через рецептор KIT/CD117 [88]; патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMP) через рецепторы TLR [89]; лектины, дсРНК через рецептор TLR4, который высвобождает TNF-α и INF-β без дегрануляции MC [90]; пептиды комплемента через рецепторы CR3, CR4, CR5 [91]; и множество других стимуляторов.

 

Системный мастоцитоз

Системный мастоцитоз (СМ) – заболевание, характеризующееся накоплением тучных клеток в органах и тканях [92]. В морфологически и иммунотипически аномальных тучных клетках [93] очень часто присутствуют мутации гена KIT [94].

В зависимости от локализации заболевание делят на:

• кожный мастоцитоз (КМ) – наиболее часто встречающийся у детей – проявляется пигментной крапивницей как диффузная или ограниченная форма мастоцитоза. Пигментная крапивница имеет хороший прогноз и обычно проходит спонтанно;
• индолентный СМ (ISM), агрессивный СМ (ASM), СМ костного мозга, тучноклеточный лейкоз (MCL) [95], а также тучноклеточная саркома [94];
• локализованная мастоцитома [95].

 

Классификация доброкачественного системного мастоцитоза человека (СМ и ISM) описана Hartmann et al., 2016 [96]. Классификация злокачественного АСМ была предложена Pardanani et al., 2010 [97]. Неопластические ТК демонстрируют специфическую экспрессию триптазы [98], CD2 и CD25 [99] и менее специфичную экспрессию антигенов CD117, CD33, CD43 и CD68 [98]. Экспрессия CD2 и CD25 диагностически важна, поскольку она не присутствует в нормальных тучных клетках [100,101]. Антиген CD30/Ki-1 (кодируемый геном TNFRSF8) также присутствует на поверхности злокачественных клеток [102]. Растворимая форма CD30 (sCD30) в концентрации до 130 нг/мл присутствует в крови больных АСМ и МКЛ [103].

В клетках системного мастоцитоза также описаны многие хромосомные аберрации, включая моносомию хромосомы X (45,X), моносомию хромосомы 7 (45,XX,-7 или 45,XY,-7), дисомию хромосомы Y (47,XYY), трисомия хромосомы 8 (47,XX,+8 или 47,XY,+8), 46,del(12)(p13) [104]. Сложные кариотипы наблюдаются редко [104].

Рецептор KIT конститутивно экспрессируется в тучных клетках. При системном мастоцитозе человека (hSM) ген KIT подвергается частой (до 80% случаев) мутации p.D816V в экзоне 17 [105]. Однако мутации отсутствуют на самых ранних стадиях заболевания [106]. Описаны и другие KIT-активирующие мутации, такие как p.V560G, p.D815K, p.D816Y, p.D816H и p.D820G, встречающиеся в hSM в общей сложности в 5% всех случаев [107]. Блокирование активности KIT с помощью PKC412 (мидостаурина) ингибирует пролиферацию клеток СМ всего на 3 года [108].

Три типа киназ рецептора тропомиозина (TRKA, TRKB и TRKC) и рецептор фактора роста нервов (NGFR) связывают нейротрофины. Фактор роста нервов (NGF) связывает TRKA, нейротрофический фактор головного мозга (BNDF). Ядерный фактор 4 (NF4) связывает TRKB. Ядерный фактор 3 (NF3) преимущественно связывает TRKC [109]. Нейротрофины увеличивают выживаемость, функцию и хемотаксис тучных клеток [110,111]. Активация TRK мыши фактором некроза опухоли (TNF) и TRKB BDNF довольно часто вызывает СМ или даже MCL [112]. Мутации TRK (особенно TRKB) активируют трансформацию опухоли и образование метастазов при мастоцитозе [111].

Аномальная активация комплексов рапамицина (mTOR)-мишени млекопитающих может играть роль в мастоцитозе [113]. Было обнаружено, что рапамицин (ингибитор киназы mTOR) снижает рост и жизнеспособность SM-клеток с мутацией KIT p.F816V [114].

Другие мутации генов, описанные при СМ, включают IDH1 и IDH2 (кодирующие изоцитратдекарбоксилазу) [115]; ERK1/ERK2 у мышей [116]; SRSF2 и SF3B1 (фактор вырезания интрона) [117]; RUNX1 (фактор вырезания интрона) [118]; КРАС и НРАС [119]; СТАТ5, АКТ [120]; ТЕТ2 [121]; SETD2 [122]; ASX1 [123]. В большинстве случаев генетические мутации присутствуют в соматических клетках. При СМ в зародышевой линии могут возникать некоторые генетические изменения. К ним относятся замены в гене KIT (p.K509I [124], p.A533D [125], p.N822J [126]) и замены в гене IL4R (p.Q576R [125]).

При СМ описаны патогенные варианты гена CEBPA (rs4616402), кодирующего транскрипционный фактор, гена TEX41 (rs4662380), кодирующего днРНК TEX41, и гена TBL1XR1 (rs13077541), кодирующего трансдуциноподобный белок 1 и связанного с X-рецептором [127].

 

Таргетная терапия

Понимание роли MC в развитии и прогрессировании рака имеет решающее значение для разработки новых таргетных методов лечения рака человека [128]. Взаимосвязь между наличием ТК в опухолях, прогрессированием ангиогенеза и развитием опухоли может повысить возможную роль ТК в биологии рака. Таким образом, блокирование высвобождения медиаторов ингибиторами тирозинкиназы (ИТК) рецептора KIT (например, иматиниб, мастиниб) может влиять на функцию МК [128,129,130], тогда как блокирование высвобождения медиаторов ингибиторами триптазы (мезилат габексата и мезилат нафамостата, оба которые являются ингибиторами трипсиноподобных сериновых протеаз) [128,131] могут быть важным терапевтическим средством для снижения роста опухоли [132].

Мезилат иматиниба (STI571) представляет собой мультикиназный ингибитор, одобренный для клинического применения при лечении хронического миелолейкоза, острого лимфобластного лейкоза (положительный в Филадельфии), стромальных опухолей желудочно-кишечного тракта (положительный по CD117) и миелоидных/лимфоидных новообразований с перестройками гена PDGFR. [133]. В качестве мишени иматиниба учитывается рецептор KIT дикого типа. Данные об эффективности иматиниба in vitro и in vivo при СМ с KIT-мутацией показали противоречивые результаты [134,135,136,137,138]. Было доказано, что некоторые редкие типы мутантов KIT, а также их аллели дикого типа (кодирующие внеклеточный и околомембранный домен) чувствительны к иматинибу в условиях in vitro. Напротив, клетки с наиболее распространенной мутацией гена KIT p.D816V (в киназном домене) не чувствительны к действию иматиниба [134,135,136,137,138]. Ответ на иматиниб зависит от наличия чувствительных к иматинибу мутаций, связанных с KIT (например, юкстамембранные или трансмембранные мутации KIT) или PDGFR (например, реаранжировка FIP1L1/PDGFRA), а не от отсутствия мутации гена KIT p.D816V [134,135,136,137,138].

Помимо иматиниба, как в доклинических, так и в клинических исследованиях анализировалась роль других ИТК. В частности, было показано, что маситиниб обладает активностью in vitro против PDGFR, тирозинкиназы Lyn, тирозинкиназы Fyn и KIT дикого типа [139]. Клинические исследования маситиниба у пациентов с мастоцитозом были сосредоточены главным образом на изучении его потенциальной полезности для лечения симптомов, связанных с медиатором MC [140,141]. Мидостаурин (PCK412) представляет собой мультикиназный ингибитор, который конкурентно связывается с сайтом связывания АТФ в каталитическом домене тирозинкиназ, что приводит к их ингибированию. Помимо активности против FLT3, он ингибирует как KIT дикого типа, так и KIT с мутацией p.D816V, а также другие протеинкиназы, такие как рецептор, содержащий вставку киназного домена (KDR), рецептор фактора роста фибробластов (FGFR), рецептор 2 фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR2), слитый белок FIP1L1/PDGFR и члены семейства серин/треониновых протеинкиназ C (PKC) [142]. Другим селективным ингибитором KIT с высоким сродством к мутантному KIT p.D816V является авапритиниб (BLU-285) [143]. Рипретиниб (DCC-2618) представляет собой новый ингибитор контроля тирозинового переключения типа II для лечения рака с мутацией KIT, включая стромальные опухоли желудочно-кишечного тракта (ГИСО). BLU-263 является ингибитором KIT p. D816V с минимальным проникновением в центральную нервную систему по сравнению с авапритинибом [144]. Другим примером высокоселективного ИТК является безукластиниб (CGT9486). Он обладает мощной активностью против KIT p.D816V и не влияет на функции других близкородственных киназ. Безукластиниб продемонстрировал предварительную клиническую активность и приемлемый профиль безопасности у пациентов с распространенными солидными опухолями, включая ГИСО [145].

 

Системный мастоцитоз собак

Системный мастоцитоз у собак описывается редко и чаще диагностируется как менее агрессивная форма мастоцитомы [146]. Обычно он проявляется в виде кожных папул, расположенных на туловище, голове, промежности и конечностях, в виде кожного мастоцитоза (КМ) или пигментной крапивницы с симптомом Дарье [147]. В дерме присутствуют инфильтраты высокодифференцированных тучных клеток. В клетках наблюдается экспрессия KIT/CD117, но обычно мутации в гене KIT и других генах, типичных для тучных клеток человека, отсутствуют [148].

Цитоплазматические гранулы тучных клеток содержат гистамин, катепсин G, химазу, триптазу, карбоксипептидазу, протеогликаны (гепарин, хондроитинсульфат), TNF, интерлейкины (такие как IL-1, IL-4, IL-5, IL-6 и IL-13) и хемокины (CCL3 и CCL4) [149]. Дегрануляция приводит к зуду, покраснению и отеку кожи, реже к кровотечениям, а также рвоте, диарее и кашлю [147].

 

Мастоцитома

Мастоцитома (МСТ) часто встречается у животных, таких как собаки, кошки и мыши, и составляет 7–21% случаев рака кожи у этих животных, но у людей она встречается довольно редко. Мастоцитома – новообразование, которое чаще всего встречается у пожилых собак (8–10 лет) в виде единичного узла на коже или подкожной клетчатке. Очаги локализуются преимущественно в коже и подкожной клетчатке, реже — в желудочно-кишечном тракте, селезенке, печени, костном мозге и нервной системе. Опухоли в областях, отличных от кожи и подкожной клетчатки, обычно представляют собой метастатические поражения. Однако в литературе сообщается о случае диагностики тучноклеточной опухоли в полости носа [150]. Мастоцитомы на коже обычно присутствуют в виде опухолей, которые могут быть лишены волос. Вокруг опухоли может появиться отек и покраснение кожи. Важно отметить, что тучные опухоли также могут демонстрировать быстрый инфильтративный рост [151].

Мастоцитомы можно в наиболее широком смысле разделить на минимально злокачественные и высокозлокачественные. Клиническая классификация MCT была впервые представлена Bostock DE [152], за ней последовали Patnaik AK [153], а также Kiupel AM [154].

Гистопатологическое исследование опухоли имеет решающее значение для постановки полного диагноза, разработки плана лечения и оценки прогноза. Существует две широко используемые шкалы оценки тучных клеток кожи: одна разработана Патнаиком, а другая — Киупелем. Оценка по Патнаику представляет собой трехступенчатую шкалу, где степень I определяет хорошо дифференцированные опухоли, ограниченные дермой; II степень — опухоли промежуточной дифференцировки, распространяющиеся в подкожную клетчатку; III степень — опухоли низкой дифференцировки, инфильтрирующие подкожную клетчатку [155]. Определенным недостатком этого метода является его субъективность. Десять гистопатологов оценили одни и те же слайды 60 тучных опухолей [156]. Согласие среди патологоанатомов было на уровне 62,1% [156]. Кюпель разработал двухэтапную классификацию, согласно которой опухоли кожи определяются как доброкачественные (низкой степени злокачественности) и злокачественные. Поражения высокой степени злокачественности характеризуются кариомегалией не менее чем в 10% исследованных клеток или не менее чем в семи фигурах митоза, трех многоядерных клетках или трех атипичных ядрах в десяти полях зрения [157]. Классификация Киупеля является более авторитетной в оценке злокачественности и возможности метастатического поражения [155]. По шкале Киупеля среднее время выживания для пациентов с доброкачественными опухолями составляет более 2 лет, тогда как для пациентов со злокачественными опухолями среднее время выживания составляет менее 16 недель [154]. Многие лаборатории продолжают указывать обе классификации в результатах своих испытаний, чтобы облегчить процесс лечения рака. Классификация тучноклеточных опухолей по Патнаику и Кюпелю неприменима для гистопатологической оценки подкожной мастоцитомы [158]. Другим прогностическим фактором является количество митозов в десяти полях зрения. Считается, что при числе митозов менее семи прогноз хороший, а число митозов выше семи соответствует среднему времени выживания 12 недель [159].

Опухоли MCT содержат большое количество хорошо дифференцированных, высокогранулярных опухолевых клеток, небольшое количество эозинофилов и рак-ассоциированных фибробластов (CAF) – особенно много в III степени по Патнаику – лимфоцитов и других клеток. Неопластические клетки MC имеют увеличенные клеточные ядра с рассеянным хроматином [160]. В этих неопластических клетках видны ядра и редкие митотические фигуры [161].

Интересно, что злокачественные МСТ (I степень по шкале Патнаика) у молодых собак могут оставаться неактивными в течение нескольких лет и даже инволютировать [161]. I степень по Патнаику на момент постановки диагноза применялась к 20% МСТ, II степень — 43,3% и III степень — 36,7%. По шкале Киупеля доброкачественных МСТ было 43,33%, а злокачественных — 56,67% [162]. Хирургическое удаление в безопасных пределах часто дает устойчивые результаты. Опухоли II степени имеют продолжительность жизни до 4 лет, а опухоли III степени — 1–2 года [162].

 

Диагностика и прогноз

Диагностика заболевания должна начинаться с физического осмотра больного и сбора анамнеза.

Тонкоигольная аспирационная биопсия (ТИАБ) является эффективным инструментом в процессе первичной диагностики тучных опухолей. Анализируя данные пациента, расположение опухоли и результат ФНАБ-исследования, можно спрогнозировать гистологический тип тучных клеток опухоли. Кожные тучноклеточные опухоли хвоста, промежности или места перехода кожи на слизистые оболочки имеют высокий метастатический потенциал и гистологически квалифицируются как злокачественные опухоли [163].

Цитоплазматические гранулы содержат отрицательно заряженные протеогликаны [164], протеазы, химазу и триптазу, а также карбоксипептидазу А3 (CPA3) [165]. Продукты распада гиалуроната влияют на активацию и миграцию клеток MC. Методика выбора – удаление узла с запасом здоровых тканей. Прогноз во многом зависит от статуса местных лимфатических узлов с использованием анализа экспрессии Ki67 [166], анализа включения бром-дуридина [166], анализа экспрессии ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA) [167], анализа AgNoR [168], Анализ плоидности клеток MCT, анализ плотности васкуляризации MCT [169], анализ экспрессии p53 [170], анализ мутации и экспрессии гена KIT [171], исследование морфологии ядер клеток [172], исследование глубины клеточной инфильтрации [173] и исследование локализации опухоли [174].

Оценка аномальной экспрессии белка рецептора тирозинкиназы (KIT) с помощью иммуногистохимии является важным прогностическим фактором, поскольку белок рецептора тирозинкиназы играет ключевую роль в пролиферации, выживании, дифференцировке и миграции тучных клеток. Выделены три паттерна экспрессии KIT. Первый тип (мембранозный, перитуморальный) включает неопухолевые клетки, а также высокодифференцированные тучноклеточные опухоли. Это указывает на неагрессивный биологический тип опухоли [175]. Второй паттерн (очаговый цитоплазматический паттерн) демонстрирует очаговую или полосатую цитоплазматическую маркировку. Напротив, диффузное цитоплазматическое мечение наблюдается в третьем паттерне. И вторая, и третья модели связаны с более коротким временем выживания и более высоким риском местного рецидива [175]. Иммуногистохимическое обнаружение фосфорилированного KIT у пациентов с MCT может предсказать прогноз и биологическое поведение [176].

При диагностике тучных опухолей также проводят анализ ядерного белка Ki67, который является маркером фракции роста клеток. В то же время ядерные белки AgNOR, визуализируемые при окрашивании серебром, являются маркерами скорости деления клеток. Высокое количество ядерных белков AgNOR указывает на повышенную скорость клеточного цикла. Таким образом, оценка Ki67, наряду с AgNOR, является важным прогностическим фактором при оценке мастоцитомы кожи. Оценка по уравнению AgNOR × Ki67 более 54 коррелирует с повышенным риском метастазирования или смерти [177]. Смит и др. описали значения AgNOR × Ki67 как детерминанты низкой пролиферации клеток в MCT II степени [178].

Всегда следует проводить оценку стадии, чтобы определить стадию развития заболевания, которая оказывает непосредственное влияние на терапевтические решения и прогноз [179]. Для оценки степени рака полезно исследовать лимфатические узлы на наличие раковых клеток, даже если в этих лимфатических узлах нет пальпируемых изменений. Однако выбор подходящего лимфатического узла может представлять множество трудностей. Поэтому полезно выполнить картирование лимфатических узлов. В результате манипуляций, связанных с хирургическим удалением опухоли, тучные гранулемы могут дегранулироваться и рекрутировать нераковые тучные клетки в окружающие лимфатические узлы. По этой причине перед хирургическим удалением поражения рекомендуется биопсия лимфатического узла [180]. Чтобы оценить лимфатические узлы, можно применить тонкоигольную аспирационную биопсию или взять весь узел для гистопатологической оценки. Такой подход позволяет внедрить соответствующий терапевтический протокол [20]. Пациентам с возможными метастазами дополнительно следует провести биопсию печени и селезенки. Инфильтрация раковыми тучными клетками возможна, даже если печень и селезенка имеют нормальную морфологию при УЗИ брюшной полости. Значительная разница в среднем времени выживания была обнаружена между собаками с метастатическими поражениями печени или селезенки и теми, чьи органы свободны от опухолевых клеток [181].

 

Белки клеток мастоцитомы

Описано несколько белков клеток мастоцитомы, играющих важную роль в процессах их пролиферации, миграции и устойчивости к апоптозу. Поверхность клеток МСТ содержит KIT/CD117, IgE, CD11b, CD18, CD44 и CD45, а иногда и CD2, CD25 и CD34 [182]. Другие белки клеток мастоцитомы описаны в таблице 2.

Белок	Функция
CD30/Ki-1 antigen	Маркер клеток болезни Ходжкина и киназы анапластической лимфомы (ALK) [183]. Показано, что CD30 экспрессируется в мастоцитозных клетках человека. Экспрессия CD30 при мастоцитозе собак ингибируется интерлейкином-4, который ингибирует пролиферацию клеток МСТ [184].
Ki67 protein (encoded by MKI67 gene)	Белок Ki67 является общим маркером раковых клеток. Его синтез ограничен фазами клеточного цикла G2 и M [185]. Белок Ki67 имеет две изоформы (320 и 359 кДа), обе из которых связывают и стабилизируют митотические хромосомы [186]. Ki67 является важным фактором развития рака [187].
WWOX protein (oxidoreductase with a WW domain)	WWOX представляет собой белок-супрессор опухолей (46 кДа) у собак [188] и мышей [189]. Белок WWOX участвует в репарации ДНК после ионизирующего излучения [190]. В клетках мастоцитомы уровень WWOX всегда сильно снижен [188].
Histamine H1 receptor (HR1) antagonists	Антагонисты HR1 (лоратидин, терфенадин) подавляют пролиферацию и снижают жизнеспособность клеток мастоцитомы. Особенно эффективны (в более высоких концентрациях) дезлорафидин, рупатадин и ципрогептадин [191].
Proliferating cell nuclear antigen (PCNA)	PCNA участвует в репликации и репарации ДНК. PCNA имеет мотив PCNA-взаимодействующего белкового бокса (PIP-бокс) и образует тример, который скользит вдоль цепи ДНК [192]. При МСТ повышенная экспрессия PCNA является плохим прогностическим фактором [193].
Integrins	Клетки MCT связывают коллаген, фибронектин и ламинин межклеточного матрикса через внеклеточный матрикс (ECM) β1 и α1-6 интегрины [194]. В частности, интегрины VLA5 являются активаторами МСТ [195]. Изменения ЕСМ генерируются рак-ассоциированными клетками фибробластов (CAF), а структура ЕСМ при мастоцитоме аналогична структуре ЕСМ в строме заживающей раны [196].
Hsp32 (heme oxygenase 1)	Hsp32 синтезируется раковыми мастоцитами человека и МТК собак [197]. Белок Hsp32 является фактором выживания клеток. Его ингибиторы включают пегилированный протопорфирин цинка (ПЭГ-ZnPP) и мидостаурин, которые ингибируют рост опухоли и индуцируют апоптоз в SM-клетках человека [198].
Hsp90	Белок является шапероном, и его уровни повышены в опухолях [199]. Hsp90 также необходим для выживания раковых клеток [200]. Гелданамицин и его производные являются ингибиторами Hsp90 [201]. Ганетеспиб (STA9090) в низких концентрациях индуцирует апоптоз клеток мастоцитомы [202].
p53	Белок экспрессируется в клетках мастоцитомы, причем самая высокая экспрессия наблюдается при I степени по Патнаику, а самая низкая — при II степени.
MCL1	Антиапоптозный белок MCL1 семейства BCL2 присутствует в клетках MCT (независимо от мутаций KIT) [203]. Снижение экспрессии белка MCL1 в опухолях увеличивает их восприимчивость к химиотерапии. В гемопоэтических клетках U937 подавление MCL1 посредством антисмысловой стратегии вызывает апоптоз [204].
Programmed cell death ligand 1 (PD-L1)	Белок-лиганд PD-L1 иммуноингибирующего рецептора запрограммированной гибели клеток 1 (PD-1) экспрессируется в 66% случаев мастоцитомы и других видов рака у собак [205]. Это плохой прогностический фактор. Рецептор PD-1 вызывает Т-клеточную инфильтрацию опухолей, тогда как PD-L1 ингибирует функцию Т-клеток. Антитела против PD-L1 реактивируют Т-клетки и увеличивают выработку IFN-γ (также при раке поджелудочной железы человека) [206]. Блокировка PD-L1 антителами может вызвать регрессию опухоли [207].
Down syndrome cell adhesion molecule (DSCAM)	Белок клеточной поверхности DSCAM важен для развития нервной системы. Мутации у человека также связаны с синдромом Дауна, болезнью Гиршпрунга и идиопатическим сколиозом [208]. Ген DSCAM собак лабрадора расположен на хромосоме 31; его мутации повышают риск МСТ до 1,66 раза. Изменения в гене DSCAM описаны при 40 типах различных видов рака [209].
Proteins involved in hyaluronic acid metabolism	Гены метаболизма гиалуроновой кислоты (у золотистых ретриверов) содержат нуклеотидный полиморфизм на 14-й хромосоме (для генов HYAL4, HYALP1 и SPAM1) и на 20-й хромосоме (для генов IPK1, HYAL1-3 и GNAI2) [210]. Нарушения метаболизма гиалуроната в коже ответственны за риск МСТ у шарпеев [211]. Продукты распада гиалуроната вызывают активацию и миграцию тучных клеток [212].
Multi-drug resistance protein 1 (MDR1)	Ген MDR1 кодирует гликопротеин, который является частью насоса, отвечающего за удаление чужеродных веществ из клетки. Он также удаляет экзогенно введенные лекарства, ранее поглощенные клеткой. Ингибирование экспрессии гена MDR1 может быть полезно при химиотерапии [213].

Таблица 2
Белки клеток мастоцитомы.

 

Мутации в клетках мастоцитомы

Мутации рецептора KIT/CD117 изучались как типичные изменения при мастоцитозе человека. В 80% случаев у человека присутствует замена гена KIT p.D816H. Потеря функции белка KIT может быть причиной синдрома пегости человека [214]. Рецептор KIT человека имеет четыре изоформы [215]. Активирующие мутации, описанные в опухолях, приводят к димеризации KIT, его множественному фосфорилированию и генерации пролиферативного сигнала, передаваемого по пути MAPK-PI3K-Akt-PLCg-JAK-Src [61]. Это создает возможность прерывать сигналы клеточной пролиферации с помощью множественных ингибиторов этих ферментов [216].

Мутации гена KIT при мастоцитоме собак встречаются в 20–30% случаев [217]. Внутренняя тандемная дупликация (ITD) в экзоне 11 включает нуклеотиды 555–559 и 571–590. Другие распространенные изменения включают делеции нуклеотидов 550–560 [218] и точечные мутации экзона 11 (p.K557insF, p.K557insP). В экзоне 8 наблюдались ITD нуклеотидов 417–421 или точечная мутация p.Q430R. В экзоне 9 обнаружено две мутации в виде замен: p.S470I и p.N508I [219]. Увеличение числа копий гена KIT часто обнаруживается в тучноклеточных опухолях собак [220].

Некоторые мутации KIT встречаются у здоровых собак, на которых МСТ никогда не воздействовал. Однако существуют породы собак, которые очень восприимчивы к МСТ, например боксеры, золотистые ретриверы, лабрадоры и бультерьеры. Это может указывать на существование зародышевых мутаций у этих конкретных пород (Таблица 3).

Ген/Сегмент ДНК	Генетический вариант/тип мутации
KIT	Зародышевые мутации в гене KIT наблюдаются нечасто и связаны, скорее, с раковыми заболеваниями, отличными от MCT. Только мутации ITD гена KIT в экзоне 11 могут быть зародышевыми при MCT [221].
TP53	Мутации TP53 присутствуют в 14,6% МСТ.
GNB1	У собак мутации GNB1 были обнаружены в кожных и подкожных MCT с тенденцией к положительному прогнозу [223].
DSCAM	Генетический вариант rs850678541, ингибирующий синтез белка DSCAM [224].
Single-nucleotide polymorphisms (SNPs)	SNP в генах HYAL1-4, SPAM1 и GNAI2 играют роль в развитии опухоли тучных клеток [210].
MCL1	Сверхэкспрессия гена миелоидного мишеневого лейкоза (MCL1) наблюдается при многих видах рака, в том числе при мастоцитоме. Он кодирует лабильный белок семейства BCL2, расположенный в митохондриях [225].
Mitochondrial D-loop sequence	Мутации D-петли в митохондриальной ДНК присутствуют у 47% собак с МСТ и обычно являются гомоплазматическими. В клетках МСТ описано шесть гаплотипов последовательностей митохондриальной ДНК [226].

Таблица 3
Генетические варианты зародышевой линии при мастоцитоме.

 

Различия доброкачественных и злокачественных форм МСТ (по Киупелю)

На сегодняшний день проведено мало сравнений между клетками МСТ при доброкачественных и злокачественных формах заболевания. Исследования в основном были сосредоточены на специфичности мутаций и различиях в экспрессии генов при двух формах заболевания.

ИТД в экзоне 11 гена KIT чаще наблюдается при злокачественных кожных МСТ с короткой выживаемостью и плохим прогнозом [227, 228], тогда как ИТД в экзоне 8 гена KIT предсказывает более длительную выживаемость и более легкое течение заболевания [229]. ITD наблюдаются также в экзонах 9, 12 и 19 гена KIT [219].

Определенные цитогенетические изменения в клетках МСТ наблюдаются в агрессивных тучных клетках. К ним относятся делеции в хромосомах 5, 20 и 21 и инсерции в хромосоме 21 [220]. Прогностически неблагоприятными являются также варианты числа копий (CNV) в виде делеций генов PTEN и FAS, а также амплификации генов MAPK3, WNT5B, FGF, FOXM1 и RAD51 [230].

Представляется наиболее важным сравнить общую экспрессию генов в клетках злокачественных форм МСТ с таковой в доброкачественных формах МСТ. Исследование, проведенное на массивах ДНК Agilent собак, показало сверхэкспрессию 450 генов и пониженную экспрессию 140 генов в МСТ с низкой степенью дифференцировки [231]. Уровень мРНК гена GSN был особенно снижен у МСТ с низкой степенью дифференцировки. Сверхэкспрессия генов FOXM1, GSN, FEN1 и KPNA2 была прогностически неблагоприятной. Авторы выбрали 13 генов, уровень экспрессии которых наиболее дифференцирован между злокачественными и доброкачественными формами МСТ (табл. 4).

Ген	Результат
CCNB	Циклин B важен для перехода от фазы G2 к митозу. CCNB является онкогеном, имеющим важное значение в процессе метастазирования [232].
FOXM1	Кодирует фактор транскрипции с доменом вилкообразной головки. FOXM1 имеет высокую экспрессию в пролиферирующих опухолевых клетках [233].
CDC20	Кодирует белок кариокинетического веретена. CDC20 является онкогеном, который может инициировать апоптоз [234].
CDCA8	Кодирует регулятор митоза в центромерном комплексе CPC.
NUF2	Кодирует белок комплекса NDC80 в кинетохоре. Замалчивание его экспрессии приводит к апоптозу [235].
NUSAP1	Кодирует белок кариокинетического веретена, который определяет выживаемость раковых клеток [236].
PRC1	Кодирует белок-регулятор цитокинеза, присутствующий в фазах G2 и М. Сверхэкспрессируется в нейронах [237].
CENPP	Кодирует белок центромеры, играет роль в функции кинетохор и во время митоза [238].
UBE2S	Кодирует фермент, конъюгирующий убиквитин, и играет роль в митозе [239].
GSN	Кодирует антионкоген, который играет роль в апоптозе. Единственный ген с более низкой экспрессией при МСТ и многих других видах рака [240].
FEN1	Кодирует эндонуклеазу, которая играет роль в синтезе ДНК и является антионкогеном [241].

Таблица 4
Экспрессия генов, различающихся между злокачественными и доброкачественными формами МСТ.

 

Последующие сравнения экспрессии генов в клетках МСТ высокого и низкого риска проводились с использованием платформы Illumina [242]. Дифференциальная экспрессия была обнаружена у 71 гена, из которых 68 генов имели повышенную экспрессию в группе высокого риска и только 3 гена имели пониженную экспрессию в этой группе. Результаты подтвердили выводы исследований, проведенных ранее. Кроме того, была обнаружена важная роль рак-ассоциированных фибробластов (CAF), которые продуцируют белки опухолевого межклеточного матрикса [243]. Клетки CAF в матриксе активируют рост и прогрессирование опухоли. Опухолеассоциированные фибробласты (TAF) аналогичны миофибробластам [244], а маркерами этих клеток являются антитела против гладкомышечных клеток (ASMA) [245].

 

Образование метастазов при мастоцитоме

Метастазирование наблюдается примерно у 25% МСТ, а его формирование представляет собой многоэтапный процесс, обусловленный изменениями экспрессии генов [246]. Гены, экспрессия которых связана с метастазированием, включают гены, кодирующие белки, участвующие в межклеточной адгезии и связывании клетки с ЕСМ. Снижение их экспрессии способствует метастазированию [246]. Паттерны экспрессии таких генов (у человека) были описаны Daves et al. [247]. Гены со значительно сниженной экспрессией при метастатическом раке перечислены в Таблице 5.

Ген	Результат
Keratin genes	Гены, кодирующие кератин, главным образом гены KRT1, KRT5 и KRT15 [248].
SDPR	Белок реакции на депривацию сыворотки. SDPR является геном-супрессором метастазирования [249].
NME1	Совместная транскрипция этого гена и соседнего нижестоящего гена (NME2) генерирует встречающиеся в природе транскрипты (NME1-NME2), которые кодируют слитый белок, содержащий последовательности, имеющие идентичность с каждым отдельным генным продуктом [250].
SHARP1	Транскрипционный фактор bHLH [251].
LIFR	Рецептор фактора ингибирования лейкоза [252].
PERP	Эффектор апоптоза TP53. Он имеет низкую экспрессию в мышиных MCT, сверхэкспрессирующих миР-9 [253].
SBSN and SFN	СБСН (супрабассейн) и СФН (стратипин).
PSORS1C2	Белок эпителиальных клеток.
CLEC3B	Член B семейства 3 доменов лектинов C-типа. Это белок-биомаркер ЕСМ метастазов.
EGR1	Реакция раннего роста 1 ген. Его продукт блокирует гепараназу, что увеличивает метастазирование.
CD9	Кодирует четырехтрансмембранный белок, блокирующий подвижность клеток [254].
BRAF and ADFN	Ген BRAF кодирует серин/треониновую киназу. Ген ADFN кодирует мультидоменный белок, участвующий в передаче сигналов и организации клеточных соединений во время эмбриогенеза. Дефицит BRAF и ADFN увеличивает подвижность клеток.
EVL, ARHGEF10, NF2	Их продукты активируют образование стрессовых волокон [255].
SCRIB	Кодирует белок полярности планарных клеток.
PKP1 and DSP	Десмосомные белки плакофилин 1 (PKP1) и десмоплакин (DSP). Их отсутствие способствует метастазированию [256].
SDC1	Кодирует белок, соединяющий цитоскелет с ЕСМ [257].
PMP22	Кодирует белок периферического миелина 22. Его сверхэкспрессия снижает подвижность клеток [258].

Таблица 5
Гены с пониженной регуляцией при метастатическом раке.

 

Сверхэкспрессия некоторых генов способствует метастазированию, в том числе гена DNAJ3A3 из семейства белков теплового шока (HSP), который способствует инвазии опухоли, и гена малой ядрышковой РНК, C/D Box 93 (SNORD93), который блокирует экспрессию генов метастазирования. 259].

Высвобождение раковой клетки из первичной ткани является частью процесса образования метастазов. Опухолевые клетки передаются по лимфатическим сосудам в регионарные лимфатические узлы и по кровеносным сосудам в отдаленные ткани. Опухоли выделяют клетки в кровоток, но только клетки, достигающие «преметастатических ниш (ПМН)», могут выжить и пролиферировать. Эти PMN образуются раковыми клетками, воспалительными клетками, рак-ассоциированными адипоцитами (CAA), опухоле-ассоциированными макрофагами (TAM) и рак-ассоциированными фибробластами (CAF), частично полученными из стволовых клеток, полученных из жировой ткани [260]. Существует три типа макрофагов: М1 (ингибирующие и убивающие раковые клетки), М2 (увеличивающие образование метастазов) [261] и ТАМ [262].

 

Роль микроРНК

Эпигенетические изменения относятся к механизмам, связывающим геном с сигналами окружающей среды для обеспечения адаптации к различным условиям, факторам и внутренним патологическим процессам [263]. Существуют различные типы эпигенетической регуляции, включая метилирование ДНК, посттранскрипционные модификации микроРНК (миРНК) и модификации гистонов [264].

МикроРНК – это небольшие РНК, участвующие в регуляции транскрипции мРНК [265]. МикроРНК могут свободно циркулировать в плазме или доставляться с помощью внеклеточных везикул (ВВ) и малых внеклеточных везикул (СВВ) [266,267]. Внеклеточные везикулы выделяются всеми типами клеток, включая нормальные клетки и опухолевые клетки. Более того, они присутствуют в жидкостях организма, включая плазму, мочу, молоко, пот, слезы, слюну и спинномозговую жидкость [268]. Играют роль в межклеточной коммуникации. Они способны переносить различные типы РНК, белков, липидов и даже фрагментов ДНК [269]. Соединения, переносимые ЭВ, могут влиять на функцию клеток-реципиентов [269]. Раковые клетки взаимодействуют не только друг с другом, но и с окружающими клетками, включая иммунные клетки, фибробласты и эндотелиальные клетки. Эта связь возможна через ЭВ, которые играют важную роль в прогрессировании опухоли [270]. Опухолевые ЭВ могут влиять на клеточный фенотип, а также на клетки микроокружения, которые поддерживают рост опухолевых клеток, их выживание и локальную инвазию, а также метастазирование [271].

МикроРНК с более высокой экспрессией в экзосомах (мембраносвязанных внеклеточных везикулах клеток МСТ) по сравнению с тучными клетками включали hsa-miR-451, hsa-miR-503, miR-Plus_27560, miRPlus_2843, miRPlus_27564, hsa-miR-583, miRPlus_1795. , miRPlus_17890, hsa-miR-663 и hsa-miR-30b [272]. Уровень экспрессии циркулирующей sEV-миР-21-5p изменяется в плазме собак на разных патологических стадиях (МСТ с узловым метастазированием или без него) [273]. Уровень sEV-miR-21-5p был значительно выше в плазме, собранной у собак с узловыми метастатическими поражениями MCT, по сравнению со здоровыми пациентами и пациентами с ранними метастатическими поражениями MCT [273].

Дерегуляция экспрессии микроРНК характерна для различных типов рака. МикроРНК могут действовать как супрессоры опухолей или онкогены. Об их значении как прогностических факторов в медицине человека и ветеринарии сообщили He et al., Agarwal et al., and Jain et al. [274,275,276]. Активация тучных клеток мыши и активация семейства миР-221-222 влияют на контрольные точки клеточного цикла [277]. Например, миР-221 регулирует дегрануляцию тучных клеток, продукцию цитокинов и адгезию клеток [278]. Фенгер и др. обнаружили, что миР-9 значительно сверхэкспрессируется в агрессивных МСТ по сравнению с доброкачественными МСТ [253].

Профиль микроРНК из фиксированных парафином тканей MCT собак был охарактеризован Zamarian et al. [279]. Панель из трех микроРНК, включая миР-21-5p, миР-379 и миР-885, имеет хорошую эффективность в различении здоровых и пораженных МСТ собак, а также собак, пораженных МСТ, с узловыми метастазами и без них [279] . Более того, в слюне собак, пораженных МСТ, миР-21-5p была идентифицирована как потенциальный негативный прогностический фактор [280]. МиР-21-5p является одной из микроРНК, активность которых повышена в MCT собак [279]. Это была одна из первых микроРНК, обнаруженных у человека как онкомиР [281]. Его сверхэкспрессия связана с онкогенезом в различных опухолях [281].

Ли и др. обнаружили, что экспрессия миР-539 и миР-381 подавляется мутированным белком KIT с заменой p.D816V. Обычно эти микроРНК участвуют в подавлении экспрессии гена MITF. В результате фактор транскрипции, индуцирующий меланоциты, отсутствует внутри клетки. Нарушение регуляции путей миР-539 и миР-381 может способствовать аномальной пролиферации МК и развитию агрессивных заболеваний МК [282].

 

Лечение

Тучные клетки являются наиболее распространенным раком кожи у собак. Заболевание заставляет ветеринаров рассматривать различные варианты лечения, включая хирургическое лечение, фармакологическое лечение и лучевую терапию. Полученные результаты следует анализировать тщательно, исходя из состояния пациента. Наиболее важным вопросом является оценка риска местного рецидива и метастазирования и только на этой основе выбор адекватного протокола ведения.

 

Хирургическое лечение

Одним из вариантов лечения тучных опухолей является хирургическое удаление очага поражения [283]. Хирургическое вмешательство обычно является полностью терапевтической процедурой при условии, что сохраняется достаточный хирургический край. В исследуемой популяции из 55 собак после полного удаления тучноклеточной опухоли II степени в 5% случаев наблюдался рецидив или метастазы [284]. Однако развитие опухоли de novo наблюдалось у 11% исследованных собак [284]. Достижение чистых краев во время хирургической резекции часто может быть самым трудным аспектом. Более того, оценка гистопатологических границ также зависит от метода доставки образца ткани в лабораторию. Важно следить за тем, чтобы разметка сечения была выполнена точно. Этого следует добиваться с помощью специальных чернил или хирургических нитей. Также следует обратить внимание на соблюдение точности при заполнении направления из лаборатории, поскольку это может облегчить постановку точного диагноза врачу, осматривающему поражение. Иногда тучные опухоли сопровождаются отеком и покраснением, а в ткани, окружающей опухоль, могут присутствовать тучные клетки, не подвергшиеся неопластической трансформации. Врач, осматривающий срез, должен различать здоровые тучные клетки и тучные клетки, трансформированные опухолью. Радиальные срезы обычно используются для постановки гистопатологического диагноза и оценки границ здоровой ткани в тучных опухолях. Хотя этот метод оказался эффективным при постановке диагноза, он может привести к трудностям при оценке границ поражения. Напротив, тангенциальные срезы являются гораздо более чувствительным методом оценки того, сохранился ли край здоровой ткани. Радиальные срезы, полученные на основе пальпации среза, позволяют получить образцы хорошего качества, которые дают общую информацию о хирургических краях. Тангенциальные сечения позволяют более точно оценить запасы. При сочетании двух методов чувствительность обнаружения «грязных» полей составляет 20% [285].

Оценка риска местного рецидива важна для последующего терапевтического процесса. Следовательно, диагностика может быть дополнительно расширена за счет молекулярного тестирования [178]. Риск местного рецидива опухолей низкой степени злокачественности — по шкале Киупеля с низким индексом Ki67 или AgNOR×Ki67 — составляет менее 10%. В то же время около 40% опухолей «высокой степени злокачественности» с мутацией в экзоне 11 гена KIT подвергаются риску рецидива, несмотря на сохранение чистых границ [178]. Большее количество AgЯОР в окрашенных серебром участках ядер связано с более высокой пролиферацией опухолетрансформированных клеток и степенью опухолевой трансформации. Количество AgNOR может быть предиктором рецидива опухоли [286]. Молекулярные изменения в раковых клетках, подвергающихся метастазированию, до сих пор плохо изучены. В мутационном статусе KIT (в экзонах 8, 9 и 11) наблюдалось 100% соответствие между первичными и метастатическими MCT у двадцати одного проспективно включенного пациента из числа собак [287]. Напротив, мутации ITD присутствовали в первичных опухолях и не были обнаружены в относительных метастазах [288].

 

Фармакологическое лечение

Фармакологическое лечение применяют преимущественно у пациентов, у которых полная хирургическая резекция невозможна или обнаружены множественные метастазы. Кроме того, терапевтические вещества можно использовать в неоадъювантной терапии. Использование глюкокортикоидов в терапии мастоцитом кожи позволяет свести на нет симптомы, связанные с дегрануляцией гранулем, такие как отек или покраснение кожи. Глюкокортикостероиды, вводимые перорально, оказывают цитотоксическое действие на трансформированные опухолью тучные клетки, а их применение имеет мало побочных эффектов [289]. Глюкокортикостероиды подавляют скорость роста опухоли и замедляют деление опухолевых клеток. Однако при отсутствии соответствующих рецепторов может развиться устойчивость к глюкокортикостероидам [290].

Химиотерапия, несмотря на ее побочные эффекты, эффективно контролирует заболевание и продлевает среднее время выживания у собак с мастоцитомой [291]. Терапия ломустином (CCNU) показала ограниченную эффективность. В группе из двадцати трех собак с МСТ на разных стадиях, по классификации Кюпеля, у одной собаки наблюдался полный ответ; семь собак дали частичный ответ; а у шести собак заболевание оставалось стабильным [292]. Винбластин относится к группе цитостатиков. Останавливает деление клеток в метафазе. Более того, это может приводить к апоптозу неделящихся клеток, повреждению васкуляризации опухоли и нарушению трансляции. Схемы лечения с использованием винбластина применяют у пациентов на поздних стадиях заболевания, когда опухоль неоперабельна, а также у собак с кожными тучноклеточными опухолями высокой степени злокачественности [293].

Таргетная терапия включает введение химических соединений, которые блокируют рост опухоли за счет воздействия на определенные молекулы, такие как ферменты и белки. Таргетная терапия менее вредна для нормальных клеток и может иметь меньше побочных эффектов по сравнению с традиционной химиотерапией. Летард и др. показали, что около 20–30% тучных опухолевых клеток имеют мутацию в рецепторе KIT, который отвечает за рост и дифференцировку тучных клеток [219]. В ветеринарии тоцераниб был первым препаратом, одобренным для таргетного лечения животных, и он до сих пор показан при тучноклеточных опухолях собак [294,295,296]. Это препарат, который одновременно воздействует на несколько рецепторов тирозинкиназ (например, рецептор фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR), PDGFR, KIT). Еще одним ИТК, одобренным для лечения тучных клеток собак, является мезилат маситиниба, который при пероральном применении позволяет МСТ с мутацией в рецепторе KIT ингибировать рост. В исследовании Летарда и др. собаки, получавшие маситиниб, показали значительно более длительную выживаемость по сравнению с группой плацебо, но только среди пациентов с мутированным рецептором KIT [219,291]. Было показано, что маситиниб ингибирует KIT и другие тирозинкиназные рецепторы, такие как PDGFR и рецептор 3 фактора роста фибробластов (FGFR3) [139,294]. В своей обзорной статье метаанализа Коэло и его коллеги отметили, что среди собак, получавших ИТК, 257 собак получали лечение согласно инструкции; 261 человек получил препарат не по назначению; и 87 собак получали маситиниб в связи с наличием неоперабельных тучных клеток (степень II или III) с подтвержденной мутацией KIT [133]. Что касается иматиниба, этот препарат не рекомендуется применять собакам [133]. Вебстер и др. обнаружили, что лечение винбластином в сочетании с преднизолоном после операции было полезным для собак с MCT III степени по сравнению с теми, которых лечили только хирургическим путем. Более того, собаки с мутациями KIT, которых лечили по этому протоколу, имели более длительный безрецидивный интервал и продолжительность выживания [171]. В большинстве случаев мастоцитомы собак молекулярный анализ не проводится регулярно; поэтому трудно оценить эффекты таргетного лечения у этих животных.

Электрохимиотерапия используется при лечении МКТ, которое сочетает внутриопухолевое/внутривенное применение специфических препаратов и лечение электрическими импульсами [297]. Электрохимиотерапия приводит к временной электропроницаемости клеточной мембраны и проникновению в клетку химиотерапевтического препарата для усиления его цитотоксического эффекта [297]. Для выполнения этой методики используют два основных препарата: блеомицин (внутриопухолевое применение) и цисплатин (внутривенное применение) [298]. Чтобы предотвратить последствия дегрануляции тучных клеток, важно сначала применять электрические импульсы на периферии опухоли, а затем перемещаться к центру [179].

 

Лучевая терапия

Тучные опухоли, удаленные с достаточным запасом здоровой ткани, обычно не требуют дальнейшего лечения [284]. К сожалению, расположение опухоли в области конечностей, головы или хвоста часто не позволяет сохранить так называемые «чистые» края, поэтому необходимо применять адъювантную терапию. Тучные опухоли II или III степени лечат лучевой терапией, что значительно снижает риск местного рецидива [299]. Мастоцитомы очень хорошо реагируют на лучевую терапию. В радикальном протоколе обычно используют фракционированное облучение. Среднее время выживания пациентов, проходящих лучевую терапию, составляло от 2 до 5 лет [300]. Лучевое лечение тучных клеток имеет дополнительное применение в качестве неоадъювантного лечения, способствующего полной резекции опухоли [300].

При использовании лечения ионизирующим излучением важно учитывать возможные побочные эффекты, которые делятся на ранние и поздние реакции. Ранние побочные эффекты включают отек, покраснение, изъязвление и жжение кожи. Поздние реакции включают лейкотрихию, изменение цвета кожи и фиброз в зоне облучения [301]. В крайних случаях это может привести к остеорадионекрозу, повреждению лимфатических и кровеносных сосудов, лимфедеме, а также к образованию другой опухоли [302].

 

Заключение

В этом обзоре обобщены достижения в исследованиях генетических изменений тучных клеток, включая точечные мутации (в основном), экспрессию генов, хромосомные аберрации и эпигенетические изменения в форме экспрессии микроРНК. Прогноз зависит от гистологического типа опухоли и уровня прогрессирования в организме. Все более совершенные диагностические методы в сочетании с современными терапевтическими подходами позволяют продлить выживаемость. Геномные знания могут быть применены на практике; например, мутации гена KIT очень часто присутствуют в клетках мастоцитомы, что влияет на прогноз заболевания. Мутации рецептора KIT/CD117 являются типичными изменениями при мастоцитозе человека. Напротив, при системном мастоцитозе наблюдается высокая экспрессия KIT/CD117, но обычно мутации гена KIT отсутствуют. Это позволяет предположить, что эпигенетические механизмы могут играть значительную роль в развитии мастоцитоза и метастазировании. Более того, было показано, что экспрессия некоторых молекул микроРНК (классифицируемых как эпигенетические механизмы) позволяет различать здоровых собак и собак, пораженных МСТ, а также собак с узловыми метастазами и без них. В нашей статье рассмотрены исследования тучных клеток, мастоцитомы и мастоцитоза, проведенные на протяжении нескольких десятилетий, и обобщены результаты исследований, проведенных в этой области. Дальнейшие исследования патобиологии тучных клеток могут привести к клиническим улучшениям, таким как лучшая диагностика и лечение людей, пострадавших от МСТ.