Иммуноцитохимия в практике ветеринарного онколога. Плюсы и минусы метода

Общая онкология

Тезисы XVIII Всероссийской конференции по онкологии мелких домашних животных
Москва, 16–17 марта 2023 г., отель «Милан»

 

Иммуноцитохимия в практике ветеринарного онколога. Плюсы и минусы метода

Евгений Андреус-Жигалко
Ветеринарный патоморфологический центр «Pathnostics», г. Москва

 

Цитологические образцы, полученные при помощи малоинвазивных методов, являются часто используемым материалом для диагностики злокачественных и доброкачественных образований, а также идентификации инфекционных агентов. В ряде случаев, когда цитоморфология является неоднозначной, могут быть применены вспомогательные методы и инструменты для получения окончательного диагноза. Одним из таких методов может быть иммуноцитохимия (ИЦХ).

ИЦХ – диагностический и исследовательский метод, использующий связывание антитела с антигеном для идентификации определенной популяции клеток. Большинство антител, применяемых на парафиновых блоках, могут с успехом использоваться на цитологических препаратах. Выработка антител к определенному антигену достигается при помощи инъекции очищенного антигена мышам или кроликам. В настоящее время доступны различные типы антител для различных типов антигенов. Моноклональные антитела распознают один специфический эпитоп на антигене, поэтому они обладают высокой специфичностью. Поликлональные антитела распознают множество эпитопов на определенном антигене, что делает их менее специфичными, но более чувствительными. Большинство доступных для коммерческого использования  антител производятся к человеческим или мышиным тканям. В ветеринарной медицине чаще используются поликлональные кроличьи антитела из-за их повышенной чувствительности.

Для ИЦХ пригодны различные типы цитологических образцов, включая цитоцентрифугаты, клеточные блоки, мазки ТИБ, окрашенные по Романовскому. Цитоцентрифугаты используются в случае с образцами небольшого клеточного объема (серозные выпоты, цереброспинальная жидкость и т. д.).  Такой тип  в меньше степени подходит для образцов с выраженной гемоделюцией. Клеточные блоки — наилучший выбор для проведения ИЦХ, потому как можно применять протоколы для иммуногистохимии без дополнительной адаптации. Клеточные блоки предпочтительнее, если предполагается использование ядерных антигенов (Ki-67, PCNA, p63, Pax5) в то время, как для определения поверхностных антигенов больше подходят цитоцентрифугаты. При определенных условиях ИЦХ может применяться на ранее окрашенных по Романовскому мазках.  В более ранних исследованиях указывалась необходимость в деколоризации мазков (Fetsch et al, 2004), однако в настоящее время это условие не является обязательным. Полная деколоризация препаратов происходит  в ходе демаскировки антигена, которая ослабляет связи между краской и клетками.

При направлении высушенных мазков при комнатной температуре, клетки остаются сохранными в течение нескольких дней. Эффективность не окрашенных препаратов можно повысить при помощи замораживания стекол при -4С. Такие препараты должны быть в пластиковых контейнерах и помещены в зип-пакеты с поглотителем влаги. Альтернативно стекла можно окунуть в 10% забуференный формалин, однако в этом случае потребуется демаскировка антигена. На исследование необходимо направлять несколько образцов, которых будет достаточно как для цитопатологического исследования, так и ИЦХ.

Методика ИЦХ включает несколько последовательных шагов (фиксация, демаскировка, инкубация первичного антитела, инкубация вторичного антитела, механизмы визуализации, допокраска клеток гематоксилином) и мало чем отличается от иммуногистохимического метода. Фиксация необходима для всех типов ИЦХ, и, как правило, определяется выбранным антителом. В качестве фиксаторов могут быть используемы метанол, охлажденный ацетон и 10% формалин. Так, например, для ядерных антигенов (p63, Ki-67, Pax5) лучше использовать 10% формалин, а затем метанол/ацетон (Gong et al., 2004). Для мембранных и цитоплазматических антигенов может быть выбран любой из перечисленных фиксаторов (Suthipintawong et al., 1996). Одним из преимуществ ИЦХ является то, что данный метод можно применять к препаратам, которые не были обработаны формалином. Однако высушенные на воздухе препараты остаются устойчивыми к условиям методики в течение нескольких дней, что является одним из основных недостатков данного метода. Обработанные формалином препараты делает антигены неузнаваемыми для антител из-за перекрестной реакции с ДНК и изменения структуры белков. Восстановить антигенные детерминанты, которые были изменены при взаимодействии с формалином, в большинстве случаев позволяет высокотемпературная обработка препаратов в водных буферных растворах (Shi et al., 1991). Демаскировка также необходима, для ИЦХ применяются ранее окрашенные по Романовскому препараты (Dorfelt et al., 2019). После демаскировки антигена приступают непосредственно к постановке ИГХ реакции, подробно описанной в ряде методических рекомендаций (Ramos-Vara and Miller, 2014).

Иммунохимическая реакция делится на иммунологическую (антиген-антитело) реакцию и цитохимическую (цветную) реакцию, которая демонстрирует первую.  Первичные антитела связываются непосредственно с искомым антигеном. В случае использования поликлональных антител необходимо использовать вторичные антитела, связанные с механизмом детекции. Эти антитела направлены к антителам (первичным) того вида животных, который использовался в их производстве. В качестве механизмов детекции для ИЦХ применяются ферментные метки. Наиболее часто используемыми ферментами являются пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза. Добавление хромогена к ферментному субстрату будет образовывать цветную реакцию. При иммунопероксидазном методе наиболее часто в качестве хромогена используется деаминобензидин, который при выпадении образует коричневый осадок.

В ветеринарной онкологии наиболее интересным применением ИЦХ может являться использование данного метода для определения фенотипа лимфоидных клеток. ИЦХ также может иметь вспомогательное значение в детекции метастазов в лимфатическом узле.

Главным недостатком данного метода является отсутствие стандартизации и контроля качества между лабораториями, особенно это касается этапа фиксации и демаскировки. ИЦХ по-прежнему остается достаточно дорогим исследованием для большинства клиник. До сих пор в ряде случаев определение положительной реакции (процент положительных клеток, интенсивность окраски) остается весьма спорным вопросом, но является критическим для онкологов в принятии решения о необходимой терапии.

 

Список литературы:

  1. Barger A, Raskin R, Flatland B, Friedrichs K, Walton R, Camus M, ed.ASVCP Quality Assurance Guidelines: Veterinary Immunocytochemistry (ICC). 2017. http://www.asvcp.org/resource/resmgr/qals/qals_icc_guidelines_11.2017.pdf. Accessed June 5, 2019.
  2. Shi SR, Key ME, Kalra KL. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. J Histochem Cytochem. 1991 Jun;39(6):741-8.
  3. Dorfelt S, Matiasek LA, Felten S, et al. Antigens under cover the preservation and demasking of selected antigens for successful poststaining immunocytochemistry of effusion, brain smears, and lymph node aspirates Vet Clin Pathol suppl 1, 2019;48: 98-107.
  4. Fetsch PA, Abati A. Ancillary techniques in cytopathology. In: Atkinson BF, ed. Atlas of Diagnostic Cytopathology, 2nd edn. Philadelphia, PA: Saunders; 2004:748‐806.
  5. Gong Y, Symmans WF, Krishnamurthy S, Patel S, Sneige N. Optimal fixation conditions for immunocytochemical analysis of estrogen receptor in cytologic specimens of breast carcinoma. Cancer 2004;102:34–40.
  6. Ramos‐Vara JA, Miller MA. When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry‐the red, brown, and blue technique. Vet Pathol. 2014;51:42‐87.
  7. Ramos-Vara JA, Avery PR & Avery AV. Advanced diagnostic techniques Raskin RE & Meyer DJ. Canine and Feline Cytology A Color Atlas and Interpretation Guide 3rd ed 2016; Elsevier St.Louis 453-494.
  8. Raskin RE, Vickers J, Ward JG, et al. Optimized immunocytochemistry using leukocyte and tissue markers on Romanowsky-stained slides from dogs and cats Vet Clin Pathol 2019;48: 88-97.
  9. Sawa M, Yabuki A, Kohyama M, et al. Rapid multiple immunofluorescent staining for the simultaneous detection of cytokeratin and vimentin in the cytology of canine tumors Vet Clin Pathol 2018;47: 326-332.
  10. Skoog L, Tani E. Immunocytochemistry: an indispensable technique in routine cytology. Cytopathology 2011;22:215—29.
  11. Suthipintawong C, Leong A-Y, Vinyuvat S. Immunostaining of cell preparations: a comparative evaluation of common fixatives and protocols. Diagn Cytopathol 1996;15:167–74.
  12. Tani EM, Christensson B, Porwit A, Skoog L. Immunocytochemical analysis and cytomorphologic diagnosis on fine-needle aspirates of lymphoproliferative disease. Acta Cytol 1988;32:209–15.
  13. Valli V, Peters E, Williams C, et al. Optimizing methods in immunocytochemistry: one laboratory’s experience. Vet Clin Pathol. 2009;38:261‐269.