Разработка антитела против кошачьего PD-1 и его функциональный анализ

Общая онкология

Shoma Nishibori, Mika K. Kaneko, Takayuki Nakagawa, Kazuo Nishigaki, Yukinari Kato, Masaya Igase, and Takuya Mizuno

 

Источник: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37095139/
Перевод: Сергеева Е. С.

 

Абстракт

Антитела против молекул иммунных контрольных точек восстанавливают функцию Т-клеток путем ингибирования связывания PD-1 и PD-L1 и, как было показано, оказывают терапевтический эффект при различных видах рака у человека. Однако на сегодняшний день не зарегистрировано ни одного моноклонального антитела, распознающего кошачьи PD-1 или PD-L1, и существует много неизвестных относительно экспрессии молекул иммунных контрольных точек и их потенциала в качестве терапевтических мишеней у кошек. Здесь мы разработали моноклональное антитело против кошачьего PD-1 (1A1-2) и обнаружили, что моноклональное антитело против собачьего PD-L1 (G11-6), которое ранее было разработано в нашей лаборатории, дает перекрестную реакцию с кошачьим PD-L1. Оба антитела ингибировали взаимодействие кошачьего PD-1 и кошачьего PD-L1 in vitro. Эти ингибирующие моноклональные антитела увеличивали выработку гамма-интерферона (IFN-γ) в активированных лимфоцитах периферической крови кошек (PBL). Кроме того, для клинического применения у кошек мы создали химерное мышино-кошачье моноклональное антитело путем слияния вариабельной области клона 1А1-2 с константной областью кошачьего IgG1 (ch-1A1-2). Ch-1A1-2 также увеличивал выработку IFN-γ в активированных PBL кошек. По данным этого исследования, 1A1-2 является первым моноклональным антителом против кошачьего PD-1, обладающим способностью ингибировать взаимодействие кошачьих PD-1 и PD-L1, а химерное антитело ch-1A1-2 будет полезным терапевтическим антителом. при опухолях кошек.

 

Ключевые слова: Иммунология опухолей, Иммунотерапия рака.

 

Введение

Рак является основной причиной смерти пожилых животных-компаньонов, таких как кошки и собаки [1–3]. Наиболее распространенные типы опухолей у кошек включают лимфому, плоскоклеточный рак, опухоль молочной железы и саркому мягких тканей [4,5]. Лечение рака у животных-компаньонов зависит от типа опухоли, гистологической степени, степени прогрессирования опухоли, общего состояния особи и финансового положения владельца. Установленные варианты лечения включают хирургическое вмешательство, лучевую терапию и химиотерапию [4,6]. Однако доступные в настоящее время методы лечения ограничены в лечении многих видов рака у кошек, особенно на поздних стадиях. Поэтому разработка новых методов лечения, отличающихся от существующих, которые можно использовать в сочетании с современными методами лечения, имеет решающее значение.

Иммунотерапия — это прорыв в терапии рака у человека и область онкологии, которая в последнее время добилась значительного прогресса [7]. Среди них молекулы иммунных контрольных точек, такие как цитотоксический антиген 4, ассоциированный с Т-лимфоцитами (CTLA-4) и запрограммированная клеточная смерть 1 (PD-1), в последнее десятилетие привлекают большое внимание. Молекулы PD-1 экспрессируются на клеточной поверхности CD4 +  и CD8 + Т-клеток, NK-клеток и антигенпрезентирующих клеток, таких как макрофаги и дендритные клетки [8,9]. Взаимодействие PD-1 с лигандом запрограммированной смерти 1 (PD-L1) подавляет экспрессию определенных антиапоптотических молекул, провоспалительных цитокинов и подавляет пролиферацию Т-клеток путем ингибирования передачи сигналов Т-клеточных рецепторов [10,11]. Однако опухолевые клетки экспрессируют PD-L1 на своей клеточной поверхности и связываются с PD-1 на инфильтрирующих опухоль лимфоцитах, что приводит к нарушению выработки цитокинов и цитотоксической активности против опухолевых клеток [12,13]. Таким образом, ингибирование пути PD-1/PD-L1 может восстановить эффекторные функции истощенных Т-клеток, а моноклональные антитела (мАт) против PD-1 или PD-L1, которые могут усиливать или восстанавливать эффекторные функции Т-клеток, привлекают внимание [14]. На основании этих результатов Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) одобрило несколько ингибиторов иммунных контрольных точек для лечения, и их терапевтические показания расширяются. Пембролизумаб и ниволумаб, разработанные для воздействия на PD-1, были впервые одобрены FDA в 2014 году [15], и с тех пор были разработаны различные моноклональные антитела против PD-1 и PD-L1 и проведены многочисленные клинические исследования [16–21]. Совсем недавно ветеринарная медицина сосредоточилась на экспрессии и функциональном анализе этих молекул иммунных контрольных точек и их полезности в качестве терапевтических мишеней у животных [22]. У собак были разработаны моноклональные антитела против PD-1/PD-L123–25, некоторые из которых показали терапевтическую эффективность в клинических исследованиях [26–29].

О нуклеотидной последовательности кошачьего PD-1 у кошек было сообщено в 2010 году, и было обнаружено, что она имеет аминокислотную последовательность, аналогичную таковой у людей и собак [30]. Также сообщалось, что экспрессия белка PD-1 и PD-L1 повышена в лимфоцитах крови кошек, хронически инфицированных вирусом иммунодефицита кошек (FIV), по сравнению с таковой у неинфицированных кошек [30]. В другом исследовании сообщалось о повышении экспрессии мРНК PD-1 и PD-L1 в мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС), полученных от кошек с клиническими признаками, связанными с инфекционным перитонитом кошек, по сравнению со здоровыми кошками [31]. Кроме того, сообщалось, что уровни PD-1 и PD-L1 в сыворотке крови были значительно выше у кошек с HER2-положительными и трижды негативными (TN) нормоподобными карциномами молочной железы [32]. Экспрессия PD-L1 в раковых клетках была значительно выше в HER2-положительных образцах, чем в нормоподобных опухолях TN [33]. Мы продемонстрировали перекрестную реактивность моноклонального антитела против человеческого PD-L1 (клон 28-8) с кошачьим PD-L1 и выявили, что PD-L1 экспрессируется в макрофагах селезенки и лимфатических узлах здоровых кошек и тучных клетках кошек. Однако на сегодняшний день не существует моноклональных антител против PD-1 и PD-L1, способных ингибировать взаимодействие этих молекул. Таким образом, остается еще много неясного с точки зрения экспрессии PD-1 и PD-L1 и функционального анализа их взаимодействий.

В этом исследовании мы разработали новое моноклональное антитело против кошачьего PD-1. Мы также показываем, что моноклональное антитело против собачьего PD-L1, которое ранее было разработано в нашей лаборатории, вступало в перекрестную реакцию с кошачьим PD-L1. Мы также показали, что эти моноклональные антитела могут ингибировать связывание PD-1/PD-L1 кошек и восстанавливать истощение лимфоцитов. Кроме того, мы создали химерные мышино-кошачьи mAb против кошачьего PD-1 для клинического использования и проанализировали их функции.

 

Полученные результаты

Разработка мАт против кошачьего PD-1 и анализ экспрессии кошачьего PD-1 в клеточных линиях.

Чтобы получить mAb против кошачьего PD-1, мы сначала создали клетки NIH3T3/fPD1, которые представляют собой клетки NIH3T3, сверхэкспрессирующие кошачий PD-1, помеченные FLAG. Клетки NIH3T3/fPD1 экспрессировали белок с молекулярной массой примерно 60 кДа, определенной методом вестерн-блоттинга с использованием антитела против FLAG (рис. 1А, левая панель). Мы иммунизировали мышей клетками NIH3T3/fPD1 и получили 288 клонов гибридом, которые были проверены методом проточной цитометрии с использованием клеток NIH3T3/fPD1. Было обнаружено, что среди этих клонов клон 1A1-2 связывается с кошачьим PD-1, экспрессируемым на клетках NIH3T3 (рис. 1B). Клон 1А1-2 представлял собой легкую каппа-цепь подкласса IgG1. Белок, экстрагированный из NIH3T3/fPD1, был обнаружен с помощью вестерн-блоттинга с использованием 1A1-2, и полоса показала ту же молекулярную массу, что и полоса, обнаруженная с помощью антитела против FLAG (рис. 1А, правая панель).

 

Специфичность моноклональных антител против PD-1 против кошачьего PD-1 и анализ экспрессии PD-1 в клеточных линиях кошек.

Рисунок 1
Специфичность моноклональных антител против PD-1 против кошачьего PD-1 и анализ экспрессии PD-1 в клеточных линиях кошек. (А) Клеточные лизаты NIH3T3 (макет) и NIH3T3/fPD1 использовали для вестерн-блоттинга. Белки разделяли с помощью SDS-PAGE на двух идентичных мембранах с последующим вестерн-блоттингом с использованием антитела против FLAG (M2) или mAb против fPD1 (1A1-2) в разных мембранах. Правый блоттинг повторно тестировали с использованием антитела против β-актина в качестве контроля загрузки белка. Показан репрезентативный результат двух независимых экспериментов. Полные изображения вестерн-блоттинга при нескольких различных временах экспозиции показаны на дополнительном рисунке к рис. 1A. (B) NIH3T3 или макет и NIH3T3/fPD1 или NIH3T3/fPD1 окрашивали серийно титрованными mAb против fPD-1 (1A1-2) с последующим окрашиванием вторичным антимышиным IgG-alexa647. (C) Проточный цитометрический анализ экспрессии кошачьего PD-1 в клеточных линиях кошек. Клеточные линии собирали и окрашивали изотипическим контролем или mAb против fPD-1 (1A1-2), а затем вторичным антителом. Красная и синяя гистограммы указывают изотипический контроль и окрашивание 1А1-2 соответственно. (D) Проточный цитометрический анализ экспрессии PD-1 кошек в линии клеток с нокаутом PD-1 кошек, клетках FT-1/ko-fPD1. Клетки FT-1 и клетки FT-1/ko-fPD1 собирали и окрашивали контрольным изотипом или mAb против PD-1 (1A1-2), а затем вторичным антителом.

 

Затем экспрессию PD-1 в клеточных линиях кошек анализировали методом проточной цитометрии с использованием клона 1А1-2. Как показано на рис. 1C, экспрессия PD-1 была обнаружена в клеточных линиях Т-клеточной лимфомы (FT-1 и FeLV-3281), клеточной линии тимической лимфомы (3201) и линии лимфобластоидных клеток, инфицированных FIV (FL-4). Экспрессия PD-1 не была обнаружена в линии клеток В-клеточной лимфомы (MS4), линии клеток, происходящих из РВМС (Fet-J), линии клеток астроцитов (G355), линии клеток макрофагов (fcwf-4) и линии клеток фибробластов. (CRFK) и все клеточные линии аденокарциномы молочной железы (FYMp, FKNp, FONp, FONm и FMCm) (таблица 11 и дополнительный рисунок). Кроме того, для подтверждения специфичности клона 1A1-2 к кошачьему PD-1 мы создали клеточную линию с нокаутом PD-1, FT-1/ko-fPD1. Связывание клона 1A1-2 с FT-1 было потеряно после нокаута fPD-1 с помощью проточной цитометрии (рис. 1D).

 

Таблица 1

Краткое изложение экспрессии PD-1 и PD-L1 в клеточных линиях кошек.

Клеточные линии Происхождение Экспрессия PD-1 Экспрессия PD-L1
IFN-γ (−) IFN-γ (+)
FT-1 Т-клеточная лимфома (FeLV+) + — —
FeLV-3281 Т-клеточная лимфома (FeLV+) + + ++
MS4 В-клеточная лимфома — + +
3201 Тимическая лимфома + — —
FL-4 Лимфобластная (FIV+) + — —
FeT-J Лимфобластная — — —
fcwf-4 Макрофаги — — + (слабо)
CRFK Фибробласты — — + (слабо)
G355 Астроциты — — —
FONp Аденокарцинома молочной железы — + ++
FYMp Аденокарцинома молочной железы — + ++
FKNp Аденокарцинома молочной железы — + ++
FONm Аденокарцинома молочной железы — — —
FMCm Аденокарцинома молочной железы — — +

 

Перекрестная реактивность mAb против собачьего PD-L1 с кошачьим PD-L1 и анализ экспрессии кошачьего PD-L1 в клеточных линиях.

Мы создали клетки NIH3T3/fPDL1, клетки NIH3T3, сверхэкспрессирующие кошачий PD-L1, меченные FLAG, и подтвердили экспрессию кошачьего PD-L1 с помощью вестерн-блоттинга с использованием антитела против FLAG, демонстрируя полосу с молекулярной массой примерно 60 кДа (рис. 2А левая панель). В нашем предыдущем исследовании мы разработали несколько моноклональных антител против собачьего PD-L124. Среди них было обнаружено, что mAb против собачьего PD-L1, клон G11-6, связывается с кошачьим PD-L1 при скрининге mAb против собачьего PD-L1 методом проточной цитометрии с использованием клеток NIH3T3/fPDL1, и никаких других антител (рис. 2Б). Однако белок, экстрагированный из NIH3T3/fPDL1, не удалось обнаружить с помощью вестерн-блоттинга с использованием клона G11-6 (данные не показаны). Поскольку клон G11-6 мог распознавать конформационный эпитоп кошачьего PD-L1, белок, экстрагированный из NIH3T3/fPDL1, подвергали иммунопреципитации с клоном G11-6 с последующим вестерн-блоттингом с использованием антитела против FLAG. В результате образуется прозрачная полоса с той же молекулярной массой, что и обнаруженная с помощью антитела против FLAG (рис. 2А, правая панель).

 

Перекрестная реактивность mAb против собачьего PD-L1 с кошачьим PD-L1 и анализ экспрессии PD-L1 в клеточных линиях кошек.

Рисунок 2.
Перекрестная реактивность mAb против собачьего PD-L1 с кошачьим PD-L1 и анализ экспрессии PD-L1 в клеточных линиях кошек. (А) Клеточные лизаты из NIH3T3 или макета и NIH3T3/fPDL1 или NIH3T3/fPDL1 экстрагировали и использовали для вестерн-блоттинга и иммунопреципитации. Вестерн-блоттинг проводили с использованием антитела против FLAG (М2). Для иммунопреципитации клеточные лизаты иммунопреципитировали с помощью mAb против собачьего PDL1 (G11-6) и проводили вестерн-блоттинг с использованием антитела против FLAG (M2). Полные изображения вестерн-блоттинга при нескольких различных временах экспозиции показаны на дополнительном рисунке к рис. 2A. (B) NIH3T3 или макет и NIH3T3/fPDL1 или NIH3T3/fPDL1 окрашивали последовательно титрованным mAb на анти-PD-L1 (G11-6) с последующим окрашиванием вторичным антикрысиным антителом IgG-DyLight649. (C) Проточный цитометрический анализ экспрессии PD-L1 кошек в клеточных линиях кошек. Клеточные линии обрабатывали IFN-γ или без него в течение 24 часов. Клеточные линии собирали и окрашивали изотипическим контролем или G11-6, а затем вторичным антителом. Красная и синяя гистограммы указывают изотипический контроль и окрашивание G11-6 соответственно. (D) Проточный цитометрический анализ экспрессии PD-L1 кошек в линии клеток с нокаутом PD-L1 кошек, клетках FYMp/ko-fPDL1. Клеточные линии обрабатывали IFN-γ или без него в течение 24 часов. Клетки FYMp и FYMp/ko-fPDL1 собирали и окрашивали изотипическим контролем или G11-6, а затем вторичным антителом.

 

Чтобы доказать, что клон G11-6 связывается с эндогенно экспрессируемым fPD-L1, экспрессию PD-L1 в клеточных линиях кошек анализировали методом проточной цитометрии с использованием клона G11-6. Как показано на рис. 2C, экспрессия PD-L1 была обнаружена в трех из пяти клеточных линий аденокарциномы молочной железы (FYMp, FKNp и FONp), линии клеток Т-клеточной лимфомы (FeLV-3281) и клетках В-клеточной лимфомы. линии (MS4), но не в клеточных линиях макрофагов (fcwf-4) и фибробластов (CRFK). Экспрессия PD-L1 индуцировалась в FYMp, FKNp, FONp и FMCm и незначительно в FeLV-3281, fcwf-4 и CRFK при культивировании в течение 24 часов с кошачьим IFN-γ. Как суммировано в таблице 2,2, ни PD-1, ни PD-L1 не экспрессировались в клеточной линии, полученной из РВМС (Fet-J), линии астроцитарных клеток (G355) и одной линии клеток аденокарциномы молочной железы (FONm) (дополнительный рисунок). Кроме того, для дальнейшей проверки специфичности моноклонального антитела к эндогенному кошачьему PD-L1 мы создали линию клеток с нокаутом кошачьего PD-L1, FYMp/ko-fPDL1. Мы подтвердили, что связывание G11-6 было полностью потеряно в клеточной линии FYMp/ko-fPDL1 с помощью проточной цитометрии (рис. 2D). Эти результаты демонстрируют специфичность G11-6 в отношении кошачьего PD-L1, который в дальнейшем использовался в качестве антитела против кошачьего PD-L1.

 

Таблица 2

Праймеры используют для клонирования и конструирования плазмидных векторов.

Название праймера Для Направление Нуклеотидные последовательности (от 5’ до 3’)
YTM1927 Клонирование полноразмерного кошачьего PD-1 F GTGGATCCCGTGGAGGAAGAGATTACGG
YTM1928 R TCGAATTCCGAGAGGAGAGCCAAGCTG
YTM1929 Клонирование полноразмерного кошачьего PD-L1 F TCGAATTCCAGCTCATTAGCGCGAGAAC
YTM1930 R CCCTCGAGTTACGTCTCCTCAAATTGTAGATC
YTM1934 Добавление тега FLAG к кошачьему PD-1 R GTCGATGTCATGATCTTTATAATC-GAGGGGCCAAGGGCA
YTM1935 Добавление тега FLAG к кошачьему PD-L1 R GTCGATGTCATGATCTTTATAATC- CGTCTCCTCAAATTG
YTM838 Усиление тега FLAG R GTCGATGTCATGATCTTTATAATCGTCGATGTCATG
YTM2387 Нокаутные олигонуклеотиды кошачьего PD-1 F CACCGTGGGGACCCCAACGGGCGCCC
YTM2388 R AAACGGGCGCCCGTGGGGTCCCCAC
YTM2106 Нокаутные олигонуклеотиды кошачьего PD-L1 F CACCGACCTGCTGCTGCAGCAGCTC
YTM2107 R AAACCGAGCTGCTGCAGCAGCAGGTC
YTM1946 Вектор экспрессии fPD1-hIg F CTTAGACTCCCCCTACAGG
YTM1947 R CGGGATCCCTGGCCTTGGCCGGT
YTM1948 Вектор экспрессии fPDL1-hIg F GTTTACGATCACAGTGTCC
YTM1949 R CGAGATCTAGTCCTCTCATTTGCTGG

 

Ингибирование связывания PD-1/PD-L1 моноклональными антителами против кошачьих PD-1 и PD-L1

Чтобы проверить, ингибируют ли эти моноклональные антитела к кошачьим PD-1 или PD-L1 связывание кошачьих PD-1 и PD-L1, внеклеточные домены кошачьих PD-1 и PD-L1 были слиты с областью человеческого IgG2 для получения растворимого Fc-слитый белок. Слитые белки fPD1-hIg и fPDL1-hIg были очищены и обнаружены по ожидаемой молекулярной массе с помощью вестерн-блоттинга с использованием антитела против человеческого IgG (рис. 3А). Кроме того, с помощью проточной цитометрии было подтверждено, что эти белки fPD1-hIg и fPDL1-hIg связываются с NIH3T3/fPDL1 и NIH3T3/fPD1 соответственно, а не с родительским NIH3T3 (рис. 3B). Предварительная инкубация NIH3T3/fPD1 с mAb против кошачьего PD-1, клон 1A1-2, ингибировала связывание fPDL1-hIg в зависимости от дозы антитела (рис. 3C, левая панель). Аналогичным образом, mAb против кошачьего PD-L1, клон G11-6, ингибировало связывание fPD1-hIg с NIH3T3/fPDL1 (рис. 3C, правая панель).

 

Ингибирование взаимодействия fPD-1 и fPD-L1 с помощью моноклональных антител.

Рисунок 3
Ингибирование взаимодействия fPD-1 и fPD-L1 с помощью моноклональных антител. (A) Вестерн-блоттинг растворимых слитых белков fPD1-hIg и fPDL1-hIg. fPD1-hIg, fPDL1-hIg и IgG2-Fc человека (hIg) очищали из супернатанта клеток Expi-293F и подвергали вестерн-блоттингу с античеловеческим IgG-пероксидазой хрена (HRP). Полное изображение вестерн-блоттинга показано на дополнительном рисунке к рис. 3А. (B) NIH3T3 или макет и NIH3T3/fPD1 и NIH3T3/fPD1 окрашивались титрованным по дозе слитым белком fPDL1-hIg (левая панель) или NIH3T3 или макет и NIH3T3/fPDL1 и NIH3T3/fPDL1 с fPD1-hIg (правая панель) с последующим окрашиванием вторичным антителом против IgG-PE человека. (C) Клетки NIH3T3/fPD1 предварительно инкубировали с серийно титрованными mAb против PD-1 (1A1-2) и после промывания инкубировали с 1 мкг/мл fPDL1-hIg или Ig человека (левая панель). Клетки NIH3T3/fPDL1 предварительно инкубировали с mAb против PD-L1 (G11-6), а после промывания инкубировали с 5 мкг/мл fPD1-hIg или Ig человека (правая панель). Затем клетки окрашивали вторичным антителом против человеческого IgG-PE.

 

Экспрессия PD-1 и PD-L1 кошек в стимулированных лимфоцитах

Для исследования экспрессии PD-1 и PD-L1 в иммунных клетках кошек была проведена проточная цитометрия с использованием моноклональных антител против fPD-1 и fPD-L1 на нестимулированных и стимулированных конканавалином А (Con A) лимфоцитах периферической крови кошек (PBL). Экспрессия PD-1 и PD-L1 не была обнаружена в нестимулированных РВМС, но митогенная стимуляция Con A в течение 48 часов индуцировала экспрессию PD-1 и PD-L1 (рис. 4).

 

Экспрессия PD-1 и PD-L1 в стимулированных лимфоцитах кошек.

Рисунок 4
Экспрессия PD-1 и PD-L1 в стимулированных лимфоцитах кошек. Лимфоциты периферической крови выделяли из периферической крови и стимулировали 10 мкг/мл конканавалина А (Кон А) в течение 48 часов. После культивирования клетки собирали и окрашивали моноклональными антителами против PD1 (1A1-2) или моноклональными антителами против PD-L1 (G11-6), а затем антителами против мышиного IgG-alexa647 или против крысиного IgG-DyLight649 соответственно.

 

Продукция IFN-γ стимулируется ингибированием PD-1/PD-L1 с помощью моноклональных антител.

Чтобы изучить эффект ингибирования связывания fPD-1/PD-L1 в лимфоцитах с помощью моноклональных антител, мы измерили уровни IFN-γ, высвободившегося из стимулированных PBL в культуральный супернатант. Как показано на рис. 5А, PBL, собранные у семи здоровых кошек, стимулировали 10 мкг/мл Con A и инкубировали с изотипическим контролем или mAb против fPD-1 в течение 48 часов. Продукция IFN-γ значительно увеличивалась в присутствии моноклональных антител против fPD-1, 1A1-2 (p = 0,018). Аналогично, добавление моноклонального антитела против fPD-L1, G11-6, также значительно увеличивало продукцию IFN-γ (p = 0,018) (рис. 5B).

 

Увеличение продукции IFN-γ в стимулированных конканавалином А (Con A) лимфоцитах периферической крови (PBL) при лечении mAb против PD-1 или mAb против PD-L1.

Рисунок 5
Увеличение продукции IFN-γ в стимулированных конканавалином А (Con A) лимфоцитах периферической крови (PBL) при лечении mAb против PD-1 или mAb против PD-L1. PBL выделяли от семи здоровых кошек и стимулировали 10 мкг/мл Con A в течение 48 часов в присутствии контрольного изотипа IgG1 мыши или mAb против fPD1 (1A1-2) (A), контроля изотипа IgG2a крысы или анти-fPDL1. (G11-6) мАт (В). Через 48 часов собирали культуральный супернатант и измеряли количество кошачьего IFN-γ в супернатантах в двух экземплярах. Разные цветные полосы обозначают разных людей.

 

Получение химерного моноклонального антитела против кошачьего PD-1 и оценка активности in vitro.

Чтобы снизить иммуногенность моноклонального антитела против fPD-1 для клинического применения, мы создали химерное мышино-кошачье моноклональное антитело (ch-1A1-2) путем слияния вариабельной области клона 1A1-2 с константной областью кошачьего IgG1 (рис. 6А). Мы подтвердили, что ch-1A1-2 специфически связывается с NIH3T3/fPD1 с помощью проточной цитометрии (рис. 6B). Мы также подтвердили, что предварительная инкубация ch-1A1-2 с NIH3T3/fPD1 ингибировала связывание fPDL1-hIg (рис. 6C). Кроме того, PBL семи здоровых кошек стимулировали 10 мкг/мл Con A в присутствии изотипического контроля или ch-1A1-2, а продукция IFN-γ значительно увеличивалась в присутствии ch-1A1-2 (p = 0,018) (рис. 6Г).

 

Создание химерного мышино-кошачьего моноклонального антитела против PD-1 и его функциональный анализ in vitro.

Рисунок 6
Создание химерного мышино-кошачьего моноклонального антитела против PD-1 и его функциональный анализ in vitro. (A) Схематический обзор мышиного mAb, 1A1-2, и химерного мышино-кошачьего mAb, ch-1A1-2. Части, полученные из последовательности мыши, обозначены синими диаграммами, а части последовательности кошки обозначены оранжевыми диаграммами. (B) NIH3T3 или макет и NIH3T3/fPD1 или NIH3T3/fPD1 окрашивали ch-1A1-2 с титрованием дозы с последующим окрашиванием вторичным антителом против кошачьего IgG-PE. (C) Клетки NIH3T3/fPD1 предварительно инкубировали с титрованной дозой ch-1A1-2 и после промывания инкубировали с 1 мкг/мл fPDL1-hIg или человеческого Ig. Затем клетки окрашивали вторичным антителом против человеческого IgG-PE. (D) PBL были изолированы от семи здоровых кошек и стимулированы 10 мкг/мл конканавалина А (Con A) в течение 48 часов в присутствии контрольного изотипа кошачьего IgG или анти-fPD1 (ch-1A1-2). Через 48 часов собирали супернатант культуры и измеряли количество кошачьего IFN-γ в двух экземплярах. Разные цветные полосы обозначают разных людей.

 

Обсуждение

В этом исследовании мы разработали новое моноклональное антитело против кошачьего PD-1 (клон 1A1-2) и показали, что моноклональное антитело против собачьего PD-L1 (клон G11-6), разработанное в нашем предыдущем исследовании [24], перекрестно реагировало с кошачьим PD-L1. Примечательно, что это первое сообщение о моноклональных антителах против кошачьих PD-1 и PD-L1, которые продемонстрировали специфичность к обеим молекулам и ингибировали взаимодействие между этими молекулами. Специфичность этих моноклональных антител очень надежна, поскольку было показано, что они связываются с клеточными линиями, сверхэкспрессирующими кошачьи PD-1 или PD-L1, и реагируют с эндогенными молекулами кошачьих PD, используя клеточные линии кошек, митоген-стимулированные лимфоциты и клеточные линии, в которых молекулы PD были нокаутированы. Однако, хотя предсказанные молекулярные массы кошачьих PD-1 и PD-L1 составляют 30 кДа и 33,4 кДа соответственно, результаты вестерн-блоттинга с использованием 1A1-2 и иммунопреципитации с использованием G11-6 показали, что молекулярные массы кошачьих PD-1 и PD-L1 составляют 30 кДа и 33,4 кДа соответственно. PD-L1 составляют примерно 60 кДа. Согласно предыдущим сообщениям, мышиные PD-1 и PD-L1 [34,35] и человеческие PD-1 и PD-L1 были гликозилированы [36,37]. Кроме того, вестерн-блоттинг собачьих PD-1 и PD-L1 также показал, что полосы имели молекулярную массу, превышающую ожидаемую [24], что указывает на то, что кошачьи PD-1 и PD-L1 гликозилированы одинаково. В частности, несколько полос с разными размерами молекулярной массы, показанные при вестерн-блоттинге кошачьего PD-1 (рис. 1А), позволяют предположить, что кошачий PD-1 был модифицирован с помощью различного гликозилирования, поскольку он имеет несколько сайтов гликозилирования, как и человеческий PD-1 [38].

В этом исследовании экспрессия PD-1 и PD-L1 не наблюдалась в нестимулированных PBL, а индуцированные уровни экспрессии PD-1 были слабыми даже при стимуляции Con A. Одна из возможных причин, почему экспрессия PD-1 в лимфоцитах кошек не был хорошо индуцирован даже стимуляцией митогеном, заключается в том, что 1A1-2 может быть недостаточно чувствительным для обнаружения PD-1 с помощью проточной цитометрии. Однако причина этого не ясна, поскольку проточный цитометрический анализ с 1A1-2 в клеточных линиях кошек позволил обнаружить достаточную экспрессию PD-1. Предыдущие эксперименты показали, что экспрессия PD-1 и PD-L1 в РВМС кошек повышалась при стимуляции митогенами и облучении [30]. Экспрессия PD-1 значительно увеличилась после митогенной стимуляции в РВМС собак [19,32]. Кроме того, экспрессия PD-1 в стимулированных РВМС является явлением, обычно наблюдаемым у мышей, людей и крупного рогатого скота [34,39,40], а результаты нашего эксперимента не согласуются с этими сообщениями. Как правило, Con A является сильным стимулятором Т-клеток, однако стимуляция Т-клеток Con A может не быть подходящим стимулятором для индукции экспрессии PD-1 у кошек.

Примечательно, что настоящее исследование является первым отчетом, оценивающим восстановление функции лимфоцитов у кошек при ингибировании связывания PD-1 и PD-L1 путем измерения уровней IFN-γ. Как анти-PD-1, так и анти-PD-L1-ингибирующие моноклональные антитела значительно повышали продукцию IFN-γ, но это увеличение продукции IFN-γ было разным у разных людей. В предыдущем исследовании на собаках также наблюдались различия в эффектах моноклональных антител, ингибирующих анти-PD-1 и анти-PD-L1, между отдельными людьми [24,25], что позволяет предположить, что различия в экспрессии PD-1 и PD-L1 в стимулированных лимфоцитах могут повлиять на результаты. Это исследование показало значительное увеличение продукции IFN-γ, стимулируемое моноклональными антителами против PD-1 или против PD-L1, но эта тенденция наблюдалась более выраженно при добавлении антитела против PD-1. Мы не можем напрямую сравнить способность этих клонов ингибировать связывание PD-1 и PD-L1 только на основе этого исследования, но это может быть вызвано разницей ингибирующих эффектов этих антител. Это также может быть связано с наличием нескольких партнеров по связыванию как для PD-1, так и для PD-L1. Было показано, что помимо связывания с PD-L1, PD-1 связывается с PD-L2, что приводит к ингибированию опосредованной рецептором Т-клеток пролиферации и продукции цитокинов [41]. Было показано, что PD-L1 связывается с CD80 в дополнение к PD-1, а CD80 ограничивает коингибирующий сигнал PD-1, одновременно способствуя CD28-опосредованной совместной стимуляции [42]. Эти механизмы на сегодняшний день не анализировались у кошек, и поэтому необходимы дальнейшие исследования для более глубокого понимания взаимодействий PD-1/PD-L1 у кошек.

На сегодняшний день сообщалось о небольшом количестве терапевтических кошачьих химерных или фелинизированных антител, и единственное коммерчески доступное антитело, называемое Фруневетмаб, представляет собой моноклональное антитело к кошачьему фактору роста нервов (NGF), предназначенное для облегчения боли при остеоартрите у кошек. Эти антитела были предназначены для нейтрализации кошачьего герпесвируса, калицивируса и NGF, а кошачьи химерные антитела были получены путем слияния константной области кошачьего IgG1 с вариабельной областью соответствующих антител [43,44]. Химерное мышино-кошачье моноклональное антитело против кошачьего PD-1, полученное в этом исследовании, ch-1A1-2, также было получено путем слияния вариабельной области с константной областью кошачьего IgG1. По данным проточной цитометрии с использованием слитого белка человеческого Ig было показано, что ch-1A1-2 обладает той же ингибирующей способностью, что и 1A1-2. Кроме того, результаты анализа IFN-γ с использованием этого химерного моноклонального антитела показали, что добавление ch-1A1-2 значительно увеличивает выработку IFN-γ, что позволяет предположить, что оно может восстановить истощение лимфоцитов. Предыдущие отчеты показали, что IgG2 встречается нечасто у здоровых кошек (~ 2%), и большинство из них продуцируют IgG1 [45]. Однако IgG1 имеет более высокое сродство к fFcγRI и fFcγRIII, чем IgG2 [45], и, таким образом, антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) может индуцироваться при введении ch-1A1-2 in vivo. В этом эксперименте мы использовали PBL, которые включали B- и NK-клетки, а также небольшое количество оставшихся моноцитов. Причина подтвержденного ингибирующего действия ch-1A1-2 связана с удалением моноцитов в этом эксперименте. Однако на сегодняшний день не было опубликовано отчета, оценивающего активность ADCC кошачьего IgG1, и необходимо выяснить, обладает ли ch-1A1-2 активностью ADCC в экспериментах in vitro и in vivo в будущем.

В заключение нам удалось получить моноклональные антитела, которые специфически связываются с кошачьими PD-1 или PD-L1, и продемонстрировать, что эти моноклональные антитела ингибируют связывание PD-1/PD-L1. Мы также показали, что ингибирование связывания PD-1/PD-L1 в лимфоцитах моноклональными антителами восстанавливает истощение лимфоцитов. Кроме того, мы получили функциональное химерное мышино-кошачье mAb против кошачьего PD-1 для клинического применения. Эти результаты позволяют предположить, что ингибирование связывания PD-1/PD-L1 в микроокружении опухоли может оказывать противоопухолевое действие у кошек и обеспечивает фундаментальные инструменты для создания терапии молекулярного ингибирования иммунных контрольных точек у кошек, а также у людей и животных. В будущем, чтобы сделать это антитело окончательно коммерциализированным, необходимы исследования безопасности и фармакокинетики антител с использованием здоровых кошек, и ожидается, что будет проведен последний этап подтверждения безопасности и противоопухолевой эффективности у кошек, больных раком.

 

Литература

  1. Cannon CM. Cats, cancer and comparative oncology. Vet. Sci. 2015;2:111–126. doi: 10.3390/vetsci2030111.
  2. Merlo DF, et al. Cancer incidence in pet dogs: Findings of the Animal Tumor Registry of Genoa, Italy. J. Vet. Intern. Med. 2008;22:976–984. doi: 10.1111/j.1939-1676.2008.0133.x.
  3. Fleming JM, Creevy KE, Promislow DEL. Mortality in north american dogs from 1984 to 2004: An investigation into age-, size-, and breed-related causes of death. J. Vet. Intern. Med. 2011;25:187–198. doi: 10.1111/j.1939-1676.2011.0695.x.
  4. Blackwood L. Cats with cancer: Where to start. J. Feline Med. Surg. 2013;15:366–377. doi: 10.1177/1098612X13483235.
  5. Graf R, et al. Swiss Feline Cancer Registry 1965–2008: The influence of sex, breed and age on tumour types and tumour locations. J. Comp. Pathol. 2016;154:195–210. doi: 10.1016/j.jcpa.2016.01.008.
  6. Biller B, et al. 2016 AAHA oncology guidelines for dogs and cats. J. Am. Anim. Hosp. Assoc. 2016;52:181–204. doi: 10.5326/JAAHA-MS-6570.
  7. He X, Xu C. Immune checkpoint signaling and cancer immunotherapy. Cell Res. 2020;30:660–669. doi: 10.1038/s41422-020-0343-4.
  8. Bally APR, Austin JW, Boss JM. Genetic and epigenetic regulation of PD-1 expression. J. Immunol. 2016;196:2431–2437. doi: 10.4049/jimmunol.1502643.
  9. Baumeister SH, Freeman GJ, Dranoff G, Sharpe AH. Coinhibitory pathways in immunotherapy for cancer. Annu. Rev. Immunol. 2016;34:539–573. doi: 10.1146/annurev-immunol-032414-112049.
  10. Muenst S, Soysal SD, Tzankov A, Hoeller S. The PD-1/PD-L1 pathway: Biological background and clinical relevance of an emerging treatment target in immunotherapy. Expert Opin. Ther. Targets. 2015;19:201–211. doi: 10.1517/14728222.2014.980235.
  11. McDermott DF, Atkins MB. PD-1 as a potential target in cancer therapy. Cancer Med. 2013;2:662–673. doi: 10.1002/cam4.106.
  12. Ahmadzadeh M, et al. Tumor antigen-specific CD8 T cells infiltrating the tumor express high levels of PD-1 and are functionally impaired. Blood. 2009;114:1537–1544. doi: 10.1182/blood-2008-12-195792.
  13. Zhang Y, Huang S, Gong D, Qin Y, Shen Q. Programmed death-1 upregulation is correlated with dysfunction of tumor-infiltrating CD8+ T lymphocytes in human non-small cell lung cancer. Cell. Mol. Immunol. 2010;7:389–395. doi: 10.1038/cmi.2010.28.
  14. Wong RM, et al. Programmed death-1 blockade enhances expansion and functional capacity of human melanoma antigen-specific CTLs. Int. Immunol. 2007;19:1223–1234. doi: 10.1093/intimm/dxm091.
  15. Sharma P, Allison JP. Immune checkpoint targeting in cancer therapy: Toward combination strategies with curative potential. Cell. 2015;161:205–214. doi: 10.1016/j.cell.2015.03.030.
  16. Jiang Y, Chen M, Nie H, Yuan Y. PD-1 and PD-L1 in cancer immunotherapy: Clinical implications and future considerations. Hum. Vaccin. Immunother. 2019;15:1111–1122. doi: 10.1080/21645515.2019.1571892.
  17. Robert C, et al. Pembrolizumab versus ipilimumab in advanced melanoma. N. Engl. J. Med. 2015;372:2521–2532. doi: 10.1056/NEJMoa1503093.
  18. Reck M, et al. Pembrolizumab versus chemotherapy for PD-L1-positive non-small-cell lung cancer. N. Engl. J. Med. 2016;375:1823–1833. doi: 10.1056/NEJMoa1606774.
  19. Ferris RL, et al. Nivolumab for recurrent squamous-cell carcinoma of the head and neck. N. Engl. J. Med. 2016;375:1856–1867. doi: 10.1056/NEJMoa1602252.
  20. Bellmunt J, et al. Pembrolizumab as second-line therapy for advanced urothelial carcinoma. N. Engl. J. Med. 2017;376:1015–1026. doi: 10.1056/NEJMoa1613683.
  21. Schmid P, et al. Atezolizumab and nab-paclitaxel in advanced triple-negative breast cancer. N. Engl. J. Med. 2018;379:2108–2121. doi: 10.1056/NEJMoa1809615.
  22. Bergman PJ. Cancer immunotherapies. Vet. Clin. North Am. Small Anim. Pract. 2019;49:881–902. doi: 10.1016/j.cvsm.2019.04.010.
  23. Coy J, Caldwell A, Chow L, Guth A, Dow S. PD-1 expression by canine T cells and functional effects of PD-1 blockade. Vet. Comp. Oncol. 2017;15:1487–1502. doi: 10.1111/vco.122948.
  24. Nemoto Y, Shosu K, Okuda M, Noguchi S, Mizuno T. Development and characterization of monoclonal antibodies against canine PD-1 and PD-L1. Vet. Immunol. Immunopathol. 2018;198:19–25. doi: 10.1016/j.vetimm.2018.02.007.
  25. Maekawa N, et al. Expression of PD-L1 on canine tumor cells and enhancement of IFN-γ production from tumor-infiltrating cells by PD-L1 blockade. PLoS ONE. 2014;9:e98415. doi: 10.1371/journal.pone.0098415.
  26. Igase M, et al. A pilot clinical study of the therapeutic antibody against canine PD-1 for advanced spontaneous cancers in dogs. Sci. Rep. 2020;10:18311. doi: 10.1038/s41598-020-75533-4.
  27. Maekawa N, et al. PD-L1 immunohistochemistry for canine cancers and clinical benefit of anti-PD-L1 antibody in dogs with pulmonary metastatic oral malignant melanoma. NPJ Precis. Oncol. 2021;5:10. doi: 10.1038/s41698-021-00147-6.
  28. Maekawa N, et al. A canine chimeric monoclonal antibody targeting PD-L1 and its clinical efficacy in canine oral malignant melanoma or undifferentiated sarcoma. Sci. Rep. 2017;7:8951. doi: 10.1038/s41598-017-09444-2.
  29. Igase M, et al. Long-term survival of dogs with stage 4 oral malignant melanoma treated with anti-canine PD-1 therapeutic antibody: A follow-up case report. Vet. Comp. Oncol. 2022 doi: 10.1111/vco.12829.
  30. Folkl A, Wen X, Kuczynski E, Clark ME, Bienzle D. Feline programmed death and its ligand: Characterization and changes with feline immunodeficiency virus infection. Vet. Immunol. Immunopathol. 2010;134:107–114. doi: 10.1016/j.vetimm.2009.10.019.
  31. Harun MSR, et al. Transcriptional profiling of feline infectious peritonitis virus infection in CRFK cells and in PBMCs from FIP diagnosed cats. Virol. J. 2013;10:329. doi: 10.1186/1743-422X-10-329.
  32. Nascimento C, et al. Serum PD-1/PD-L1 levels, tumor expression and PD-L1 somatic mutations in HER2-positive and triple negative normal-like feline mammary carcinoma subtypes. Cancers. 2020;12:1386. doi: 10.3390/cancers12061386.
  33. Nascimento C, Gameiro A, Correia J, Ferreira J, Ferreira F. The landscape of tumor-infiltrating immune cells in feline mammary carcinoma: Pathological and clinical implications. Cells. 2022;11:2578. doi: 10.3390/cells11162578.
  34. Agata Y, et al. Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes. Int. Immunol. 1996;8:765–772. doi: 10.1093/intimm/8.5.765.
  35. Yamazaki T, et al. Expression of programmed death 1 ligands by murine T cells and APC. J. Immunol. 2002;169:5538–5545. doi: 10.4049/jimmunol.169.10.5538.
  36. Liu K, et al. N-glycosylation of PD-1 promotes binding of camrelizumab. EMBO Rep. 2020;21:e51444. doi: 10.15252/embr.202051444.
  37. Li C-W, et al. Glycosylation and stabilization of programmed death ligand-1 suppresses T-cell activity. Nat. Commun. 2016;7:12632. doi: 10.1038/ncomms12632.
  38. Sun L, et al. Targeting glycosylated PD-1 induces potent antitumor immunity. Cancer Res. 2020;80:2298–2310. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-19-3133.
  39. Francisco LM, Sage PT, Sharpe AH. The PD-1 pathway in tolerance and autoimmunity. Immunol. Rev. 2010;236:219–242. doi: 10.1111/j.1600-065X.2010.00923.x.
  40. Ikebuchi R, et al. Blockade of bovine PD-1 increases T cell function and inhibits bovine leukemia virus expression in B cells in vitro. Vet. Res. 2013;44:59. doi: 10.1186/1297-9716-44-59.
  41. Latchman Y, et al. PD-L2 is a second ligand for PD-1 and inhibits T cell activation. Nat. Immunol. 2001;2:261–268. doi: 10.1038/85330.
  42. Sugiura D, et al. Restriction of PD-1 function by cis-PD-L1/CD80 interactions is required for optimal T cell responses. Science. 2019;364:558–566. doi: 10.1126/science.aav7062.
  43. Umehashi M, et al. Post-exposure treatment of cats with mouse-cat chimeric antibodies against feline herpesvirus type 1 and feline calicivirus. J. Vet. Med. Sci. 2002;64:1017–1021. doi: 10.1292/jvms.64.1017.
  44. Gearing DP, et al. In vitro and in vivo characterization of a fully felinized therapeutic anti-nerve growth factor monoclonal antibody for the treatment of pain in cats. J. Vet. Intern. Med. 2016;30:1129–1137. doi: 10.1111/jvim.13985.
  45. Strietzel CJ, et al. In vitro functional characterization of feline IgGs. Vet. Immunol. Immunopathol. 2014;158:214–223. doi: 10.1016/j.vetimm.2014.01.012.
  46. Morita S, Kojima T, Kitamura T. Plat-E: An efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Ther. 2000;7:1063–1066. doi: 10.1038/sj.gt.3301206.
  47. Jainchill JL, Aaronson SA, Todaro GJ. Murine sarcoma and leukemia viruses: assay using clonal lines of contact-inhibited mouse cells. J. Virol. 1969;4:549–553. doi: 10.1128/jvi.4.5.549-553.1969.
  48. Crandell RA, Fabricant CG, Nelson-Rees WA. Development, characterization, and viral susceptibility of a feline (Felis catus) renal cell line (CRFK) In Vitro. 1973;9:176–185. doi: 10.1007/BF02618435.
  49. Pedersen NC, Boyle JF, Floyd K. Infection studies in kittens, using feline infectious peritonitis virus propagated in cell culture. Am. J. Vet. Res. 1981;42:363–367.
  50. Snyder HW, Jr, Hardy WD, Jr, Zuckerman EE, Fleissner E. Characterisation of a tumour-specific antigen on the surface of feline lymphosarcoma cells. Nature. 1978;275:656–658. doi: 10.1038/275656a0.
  51. Dunn KJ, Yuan CC, Blair DG. A phenotypic host range alteration determines RD114 virus restriction in feline embryonic cells. J. Virol. 1993;67:4704–4711. doi: 10.1128/jvi.67.8.4704-4711.1993.
  52. Miura T, et al. Structural abnormality and over-expression of the myc gene in feline leukemias. Int. J. Cancer. 1987;40:564–569. doi: 10.1002/ijc.2910400422.
  53. Mochizuki H, et al. Establishment of a novel feline leukemia virus (FeLV)-negative B-cell cell line from a cat with B-cell lymphoma. Vet. Immunol. Immunopathol. 2011;140:307–311. doi: 10.1016/j.vetimm.2010.12.010.
  54. Yamamoto JK, et al. Development of IL-2-independent feline lymphoid cell lines chronically infected with feline immunodeficiency virus: Importance for diagnostic reagents and vaccines. Intervirology. 1991;32:361–375. doi: 10.1159/000150220.
  55. Hohdatsu T, Hirabayashi H, Motokawa K, Koyama H. Comparative study of the cell tropism of feline immunodeficiency virus isolates of subtypes A, B and D classified on the basis of the env gene V3–V5 sequence. J. Gen. Virol. 1996;77(Pt 1):93–100. doi: 10.1099/0022-1317-77-1-93.
  56. Uyama R, et al. Establishment and characterization of eight feline mammary adenocarcinoma cell lines. J. Vet. Med. Sci. 2005;67:1273–1276. doi: 10.1292/jvms.67.1273.
  57. Fujino Y, et al. Characterization of a newly established nonproducer lymphoma cell line for feline leukemia virus. Vet. Immunol. Immunopathol. 2004;102:429–439. doi: 10.1016/j.vetimm.2004.08.009.
  58. Maekawa N, et al. Molecular characterization of feline immune checkpoint molecules and establishment of PD-L1 immunohistochemistry for feline tumors. PLoS ONE. 2023;18:e0281143. doi: 10.1371/journal.pone.0281143.
  59. Mizuno T, Suzuki R, Umeki S, Okuda M. Crossreactivity of antibodies to canine CD25 and Foxp3 and identification of canine CD4+CD25 +Foxp3+ cells in canine peripheral blood. J. Vet. Med. Sci. 2009;71:1561–1568. doi: 10.1292/jvms.001561.
  60. Sakai O, Ogino S, Tsukui T, Igase M, Mizuno T. Development of a monoclonal antibody for the detection of anti-canine CD20 chimeric antigen receptor expression on canine CD20 chimeric antigen receptor-transduced T cells. J. Vet. Med. Sci. 2021;83:1495–1499. doi: 10.1292/jvms.21-0326.