Kim Wong, Federico Abascal, Latasha Ludwig, Heike Aupperle-Lellbach, Julia Grassinger, Colin W. Wright, Simon J. Allison, Emma Pinder, Roger M. Phillips, Laura P. Romero, Arnon Gal, Patrick J. Roady, Isabel Pires, Franco Guscetti, John S. Munday, Maria C. Peleteiro, Carlos A. Pinto, Tânia Carvalho, João Cota, Elizabeth C. Du Plessis, Fernando Constantino-Casas, Stephanie Plog, Lars Moe, Simone de Brot, Ingrid Bemelmans, Renée Laufer Amorim, Smitha R. Georgy, Justina Prada, Jorge del Pozo, Marianne Heimann, Louisiane de Carvalho Nunes, Outi Simola, Paolo Pazzi, Johan Steyl, Rodrigo Ubukata, Peter Vajdovich, Simon L. Priestnall, Alejandro Suárez-Bonnet, Franco Roperto, Francesca Millanta, Chiara Palmieri, Ana L. Ortiz, Claudio S. L. Barros, Aldo Gava, Minna E. Söderström, Marie O’Donnell, Robert Klopfleisch, Andrea Manrique-Rincón, Inigo Martincorena, Ingrid Ferreira, Mark J. Arends, Geoffrey A. Wood, David J. Adams, and Louise van der Weyden
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10464500/
Перевод: Е. С. Сергеева
Абстракт
У людей мышечно-инвазивный рак мочевого пузыря (МИРМП) очень агрессивен и связан с плохим прогнозом. Учитывая высокую мутационную нагрузку и большое количество изменённых генов, необходимы стратегии определения ключевых движущих событий. У собак и кошек развивается уротелиальная карцинома (УК), гистологическое и клиническое сходство с MIBC человека. У крупного рогатого скота, пасущегося на папоротнике-орляке, также развивается УК, связанный с воздействием канцерогена птакилозида. Эти виды могут представлять собой соответствующие модели спонтанного и канцерогенного УК на животных, которые могут дать представление о MIBC у человека.
Полученные результаты
Секвенирование всего экзома УК домашних собак (n = 87) и кошек (n = 23), а также сравнительный анализ с человеческим MIBC выявили более низкую частоту мутаций в случаях животных и отсутствие мутационных сигнатур APOBEC. Обнаружена конвергенция генов-драйверов (ARID1A, KDM6A, TP53, FAT1 и NRAS), а также общие фокально амплифицированные и удалённые гены, участвующие в регуляции клеточного цикла и ремоделировании хроматина. Мы идентифицируем дефицит репарации несоответствия у подмножества УК у собак и кошек с биаллельной инактивацией MSH2. УК крупного рогатого скота (n = 8) совершенно другой; мы идентифицируем новые мутационные признаки, которые повторяются in vitro в клетках УК мочевого пузыря человека, обработанных экстрактами папоротника-орляка или очищенным птакилозидом.
Заключение
УК мочевого пузыря у собак и кошек представляет собой соответствующую модель MIBC у человека, а межвидовой анализ может выявить эволюционно консервативные гены-драйверы. Мы охарактеризовали мутационные признаки УК крупного рогатого скота, связанные с воздействием папоротника-орляка и птакилозида, воздействием рака, связанным с человеком. Наша работа демонстрирует актуальность межвидового сравнительного анализа для понимания УК как у человека, так и у животных.
Ключевые слова: Собаки, Кошки, Крупный рогатый скот, Мочевой пузырь, Рак, Мутационная сигнатура, Папоротник-орляк, Птакилозид, Pteridium aquilinum, Межвидовое сравнение.
Заболеваемость раком мочевого пузыря (РМП) у людей значительно варьируется в разных странах, в основном из-за различного воздействия установленных факторов риска, таких как курение, мышьяк в питьевой воде и химические канцерогены (такие как ароматические амины) в результате профессионального воздействия и эндемических заболеваний. хронические инфекции мочевыводящих путей, вызванные шистосомой [1]. В США UBC остается четвертым по распространенности раком у мужчин и, по прогнозам, будет причиной 4% всех случаев смерти от рака в 2022 году [2]. В США, Великобритании и Европе >90% случаев UBC представляют собой уротелиальную карциному (UC; ранее известную как переходно-клеточная карцинома, TCC). На момент постановки диагноза примерно 25% УК являются мышечно-инвазивными (МИРМЦ); высокоагрессивные опухоли, которые считаются высоким риском из-за их склонности к быстрому росту и метастазированию. Рекомендуется неоадъювантная химиотерапия на основе платины с последующей радикальной цистэктомией с диссекцией лимфатических узлов. Однако это не всегда возможно, и 5-летняя выживаемость составляет лишь 38%, если опухоль распространилась на окружающие ткани или регионарные лимфатические узлы (6% при наличии отдаленных метастазов) [2]. Несмотря на прогресс, достигнутый в разработке вариантов лечения, таких как ингибиторы иммунных контрольных точек, которые в настоящее время предлагаются в клинических испытаниях [3–5], прогноз остается плохим [6, 7].
Хотя как химически вызванные канцерогенами, так и генно-инженерные мышиные модели MIBC [8, 9] имеют некоторые гистологические и молекулярные сходства с человеческим MIBC, спонтанно возникающий УК мочевого пузыря у домашних собак и кошек может иметь явные преимущества в качестве моделей MIBC. Собаки и кошки представляют собой генетически гетерогенную популяцию, имеющую те же сопутствующие заболевания и окружающую среду, что и люди [10–13], и УК является их наиболее распространенным типом UBC. Кроме того, большинство УК мочевого пузыря у собак и кошек также являются высокодифференцированными и инвазивными, с высокой склонностью как к рецидивам, так и к метастазам [14]. В некоторых странах наблюдается высокая распространенность UBC у крупного рогатого скота, связанная с хроническим употреблением в пищу папоротника-орляка (BF; Pteridium aquilinum (L.) Kuhn) [15], который содержит несколько токсичных компонентов, включая канцероген птакилозид (PT) [16]. УК является наиболее распространенным типом поражения стенки мочевого пузыря у этого крупного рогатого скота [17], и, таким образом, крупный рогатый скот, потреблявший БФ, может представлять собой животную модель УК, вызванного канцерогенами. Дополнительная актуальность этой модели обусловлена тем фактом, что люди могут подвергаться воздействию ПТ при вдыхании спор, потреблении молока крупного рогатого скота, которого кормят BF [18, 19], а также из грунтовых вод из регионов, где растет BF [20]. Кроме того, недавно было показано, что BF, используемый людьми в пищу или в традиционной медицине, содержит обнаруживаемые уровни PT [21].
Здесь мы секвенировали экзомы собачьего, кошачьего и бычьего УК, сопоставили нормальные ткани и профилировали соматические мутации и изменения числа копий. Секвенирование подобранной нормальной ткани также позволило нам искать варианты зародышевой линии, которые могут предрасполагать к УК. Мы провели сравнительный межвидовой анализ с MIBC человека и выявили важные различия между моделями животных и УК человека, в то время как сходства между видами позволили нам уточнить список генов-кандидатов-драйверов, ранее идентифицированных в MIBC человека.
Полученные результаты
Цельноэкзомное секвенирование УК мочевого пузыря у собак, кошек и коров
Мы выполнили полноэкзомное секвенирование (WES) опухоли и сопоставили нормальную ткань с самой большой на сегодняшний день когортой образцов собак с нормальными опухолями УК (n = 87 случаев; 29 кобелей и 58 сук, представляющих 36 различных чистых и смешанных пород). Первая когорта образцов УК кошек (n = 23 случая; 14 самцов и 9 самок, представляющих 6 различных пород) и образцов УК крупного рогатого скота (n = 8 случаев от 7 самок, которые паслись на пастбищах, где растут BF; у одной коровы было 2 независимые поражения). Выборки были собраны из нескольких учреждений (n = 25) в разных странах (n = 17), чтобы свести к минимуму систематическую ошибку в оценке и учесть географические различия. Сводная информация о случаях этих трех видов, их географическом местоположении и данных о сигналах представлена в Дополнительном файле 1: Таблица S1. Для каждой когорты мы профилировали соматические мутации, изменения числа соматических копий (SCNA), варианты зародышевой линии и мутационные сигнатуры, а также провели сравнительный анализ с ранее опубликованной когортой из 412 образцов MIBC человека WES, собранных из 36 учреждений в 6 странах [22]). Примеры опухолевой патологии УК у собак, кошек, крупного рогатого скота и человека показаны в Дополнительном файле 2: Рис. S1.
Межвидовое сравнение часто мутирующих генов
Чтобы получить представление о соматическом мутационном ландшафте экзомов УК у разных видов, мы идентифицировали соматические однонуклеотидные варианты (SNV), многонуклеотидные варианты (MNV) и небольшие инсерции/делеции (инделеции), присутствующие у собак и кошек, и случаев УК у крупного рогатого скота (Дополнительный файл 3: Таблица S2, Дополнительный файл 4: Таблица S3 и Дополнительный файл 5: Таблица S4 соответственно) и сравнил эти каталоги мутаций с мутациями, обнаруженными при УК у человека, выявив как заметные сходства, так и различия между разновидность. При медиане 5,5 мутаций/МБ человеческий MIBC имеет один из самых высоких показателей соматических мутаций [23], уровни которых аналогичны тем, которые наблюдаются при немелкоклеточном раке легкого и меланоме [24]. Более низкая частота соматических мутаций наблюдалась при УК собак (медиана 1,0 мутаций/МБ; 0,94 SNV или MNV/МБ и 0,074 индел/МБ) и ЯК кошек (медиана 1,1 мутаций/МБ; 0,96 SNV или MNV/МБ и 0,18 индел/МБ). Однако у крупного рогатого скота УК имел значительно более высокие показатели (медиана 65 мутаций/МБ; 51 SNV или MNV/МБ и 11 индел/МБ), что отражает воздействие сильного мутагена окружающей среды. Высокая частота мутаций в образцах крупного рогатого скота затрудняет любые сравнения всего экзома с другими тремя видами, поскольку большая часть генов имеет мутации-пассажиры, и, таким образом, были проведены только межвидовые сравнения между УК человека, собаки и кошки.
В отличие от MIBC человека, при котором BRAF мутирует в 2,7% случаев [22], наиболее часто мутирующим геном при УК собак (53/87, 61%) был BRAF, как сообщалось ранее [25–28] (рис. 1а). В этих случаях наблюдался эквивалент мутации горячей точки BRAF p.V600E человека, BRAF p.V588E (относительно канонического транскрипта ENSCAFT00000006305.5; также известного как p.V595E). Существует сильная породная предрасположенность к УК мочевого пузыря у собак; например, шотландские терьеры и вест-хайленд-уайт-терьеры имеют повышенный риск, хотя наследственные факторы риска еще не идентифицированы [29, 30]. В нашей когорте собак мы обнаружили, что соматическая мутация BRAF была значительно выше (p = 0,0313, критерий хи-квадрат) у пород терьеров (19/24) по сравнению с не-терьерами (34/63). Используя алгоритм DISCOVER [31], мы не обнаружили никаких взаимоисключающих или одновременно встречающихся мутировавших генов ни во всей когорте, ни при сравнении опухолей с мутировавшим и диким типом BRAF, что позволяет предположить отсутствие различий в ландшафте генов-драйверов между этими опухолями. Недавний WES осадков мочи собак без обнаруживаемого BRAF V595E (по данным ddPCR) выявил 46% образцов, содержащих короткие делеции в рамке считывания в экзоне 12 BRAF (7 из 28 случаев) или экзонах 2/3 MAP2K1 (6 из 28 случаев) [32]. Авторы предложили эти генетические изменения как альтернативные события, активирующие путь MAPK. В нашей когорте у нас было 2 из 87 образцов с короткими делециями в рамке считывания в экзоне 2 MAP2K1 (оба из которых не несли мутацию BRAF V595E); однако мы не обнаружили ни одного образца, демонстрирующего делеции в рамке кадра в экзоне 12 BRAF, что согласуется с предыдущим исследованием WES UC мочевого пузыря у собак [28].
Рисунок 1
Соматический мутационный ландшафт УК мочевого пузыря собак. Соматические мутации в генах, мутировавших в пяти и более образцах. Звездочка указывает на значительно мутировавший ген (SMG); GPRASP1 также является SMG, но не показан, поскольку он мутирован в двух образцах. Краткое описание случаев у собак, проанализированных в этом исследовании, представлено в Дополнительном файле 1: Таблица S1a, а полный список вариантов представлен в Дополнительном файле 3: Таблица S2. б Замещение одного основания (SBS) выявило мутационные спектры и реконструированные спектры для образцов DD0194a и DD0355a. Мутационные сигнатуры SBS1 и SBS6 были обнаружены в обоих образцах, а также SBS21 в образце DD0194a. Восстановленные мутационные спектры на основе этих сигнатур имеют косинусоидальное сходство > 0,93 по сравнению с наблюдаемыми спектрами.
В отличие от УК собак, секвенирование экзома первой на сегодняшний день когорты УК кошек выявило сходство с MIBC человека, поскольку наиболее часто мутировавшим геном был TP53 (14/23, 61%). Примечательно, что большинство этих мутаций были мутациями потери функции (рис. 2а). В когорте кошек с УК не было обнаружено взаимоисключающих или одновременно встречающихся мутированных генов.
Рисунок 2
Соматический мутационный ландшафт УК мочевого пузыря кошек. Соматические мутации в генах, мутировавших в трех и более образцах. Звездочка указывает на значительно мутировавший ген (SMG). Краткое описание случаев заболевания кошек, проанализированных в этом исследовании, представлено в Дополнительном файле 1: Таблица S1b, а список всех вариантов представлен в Дополнительном файле 4: Таблица S3. б Мутационный спектр одной пары оснований (SBS) для образца CATD0037a (верхняя панель). Активность мутационных сигнатур SBS1, SBS6, SBS20 и SBS21 показана в реконструированном мутационном спектре (нижняя панель). c Мутационный спектр Indel для образца CATD0037a, показывающий преобладание делеций одной пары оснований в областях гомополимера. d График пенетрантности, показывающий увеличение и потерю числа соматических копий на 5 МБ или более в окнах размером 1 МБ вдоль каждой хромосомы. Представлены только образцы достаточного качества, полученные на основе ручной проверки графиков секвенцы (n = 21; см. «Методы»).
В когорте бычьего УК во всех случаях наблюдались мутации CSMD3, LRP1B и ROS1. Интересно, что у коровы BTAUD0031 было два независимых первичных поражения УК (BTAUD0031a и BTAUD0031c), и единственная общая для них мутация была в предполагаемом супрессоре опухоли LRP1B (p.S2686P), что указывает на то, что это является движущей мутацией в опухолях этой коровы. Ранее предполагалось, что активация HRAS представляет собой раннее событие модели канцерогенеза PT [33, 34]; однако только один образец (BTAUD0031c) имел мутацию в HRAS (p.G12D, который гомологичен HRAS p.G12D человека), и мы не обнаружили никаких немолчащих мутаций в KRAS или NRAS, что позволяет предположить, что онкогены RAS не являются частые причины канцерогенеза, индуцированного BF.
При сравнении УК собак и кошек в профилях соматических мутаций по всему экзому у этих видов было обнаружено только 5 рекуррентно мутировавших генов (определяемых как гены, мутировавшие в ≥ 5% образцов у обоих видов): ZFHX4, FSIP2, USH2A, LRP1B и XIRP2 (дополнительные данные, файл 6: рис. S2a). Также было небольшое совпадение при сравнении генов COSMIC Cancer Gene Census (CGC), которые имеют ортологическую связь один к одному с геном собаки и кошки (рис. 3а). Только LRP1B входил в число 5 наиболее часто мутировавших генов CGC как при УК собак, так и у кошек, при этом УК собак в основном характеризовался мутациями в BRAF, LRP1B, CSMD3 и ARID1A, а УК кошек — мутациями в TP53, LRP1B и FAT1 (рис. 3а). Аналогичным образом, за исключением TP53 при УК кошек, наиболее часто мутирующие гены в ММРМЖ человека не мутируют в одинаковых пропорциях при УК кошек или собак (дополнительный файл 6: рис. S2b), возможно, из-за более высокой частоты мутаций в ММРМЖ человека.
Рисунок 3
Сравнительный мутационный ландшафт УК мочевого пузыря человека, собак и кошек. a Доля случаев MIBC у человека [22] (n = 412) с соматическими мутациями в генах COSMIC Cancer Gene Census, которые имеют прямое ортологическое родство как с собачьим, так и с кошачьим геном. Показаны мутации, присутствующие в 4 или более образцах собак или кошек, которым присвоены префиксы DD и CATD соответственно. Также показаны образцы собак с амплификацией MDM2, которая показана в том же ряду, что и мутации TP53, чтобы обеспечить визуальное сравнение с мутациями TP53 у кошек и людей. CDKN2A не был включен, поскольку, хотя в когорте кошек было 4 образца с мутациями CDKN2A, Ensembl не классифицирует гены человека и кошки как ортологи, а у собак человеческий CDKN2B обозначен как ортолог собачьего CDKN2A. b График Циркоса, показывающий геномные области с повторяющимися изменениями числа соматических копий при УК у человека, кошек и собак. Хромосомы представлены внешней дорожкой. Данные для человеческой хромосомы X не были доступны. Гистограмма (внутренняя дорожка) показывает частоту увеличения количества копий (фиолетовый, синий и зеленый) и потерь (оранжевый, красный и желтый) у человека, собаки и кошки соответственно. Связи между хромосомами показывают синтенные области внутри рекуррентно амплифицированных/удаляемых хромосом (кошки и собаки) или плеч хромосом (человека). Красные ссылки представляют собой делеции, а фиолетовые ссылки представляют собой амплификации. Гены, показанные оранжевым и фиолетовым текстом, находятся в синтенных областях хромосом или плеч хромосом, которые были рекуррентно удалены или амплифицированы, соответственно, у всех трех видов. Гены, выделенные красным и синим текстом, представляют собой гены, которые были фокально амплифицированы или удалены у двух или более видов. ARHGEF10 — единственный ген, фокально удаленный у всех трех видов. Черным текстом показаны другие представляющие интерес гены.
Межвидовое сравнение значительно мутировавших генов идентифицирует общие гены-драйверы при ММРМЖ человека и УК у животных.
Затем мы идентифицировали значительно мутировавшие гены (SMG) у каждого вида и сравнили их с ранее выявленными в MIBC человека. При УК у собак мы идентифицировали 9 значительно мутированных генов (BRAF, CSMD3, CDH12, ARID1A, PCDH17, KMD6A, ZNF804B, PCDH9 и GPRASP1; Дополнительный файл 7: Таблица S5). Не наблюдалось совпадения с 9 SMG, обнаруженными при УК кошек (TP53, BAP1, FAT1, PBRM1, LRP1B, SETD2, NRAS, CDKN2A и JAK1; Дополнительный файл 8: Таблица S6). В случаях УК у крупного рогатого скота, когда 4–16% (в среднем 11%) экзома страдают мутациями, изменяющими белок, анализ генов-кандидатов-драйверов был затруднен. Например, при рассмотрении однозначных ортологов генов COSMIC CGC [35] мы обнаружили 13 генов с одной и более мутациями в 6 и более образцах (рис. 4), а 54 гена обычно мутировали как минимум в половине образцы (дополнительный файл 9: рис. S3), что указывает на высокую фоновую частоту мутаций. Из-за этого ограничения и небольшого размера когорты не удалось окончательно идентифицировать существенно мутировавшие гены (см. «Методы»).
Рисунок 4
Рекуррентно мутированные гены переписи генов рака (CGC) при УК мочевого пузыря крупного рогатого скота. Показаны гены COSMIC CGC, мутировавшие как минимум в 6 случаях УК крупного рогатого скота (слева), а также доля случаев УК у человека [22] с мутациями в этих генах (справа). Показанные гены — это те, которые имели ортологическое отношение один к одному между человеческим и бычьим геном.
Сравнение SMG, обнаруженных при УК собак и кошек, с теми, которые обнаружены в ММРМЖ человека, выявило сходство, которое может помочь в уточнении и определении приоритетности списков генов-кандидатов при УК человека. Робертсон и др. [22] идентифицировали 58 SMG в MIBC человека. Из них ARID1A и KDM6A являются SMG при УК у собак, а TP53, FAT1, NRAS и SMG при УК у кошек, что указывает на то, что они являются ключевыми генами-драйверами УК у разных видов. В когорте бычьего УК, хотя небольшой размер выборки и высокая частота мутаций не позволили идентифицировать SMG, стоит отметить, что ARID1A и FAT1 также были мутированы в 6/8 (75%) образцов. Кроме того, CSMD3 и LRP1B, которые были идентифицированы как SMG при УК собак и кошек соответственно, были мутированы во всех восьми образцах УК крупного рогатого скота.
Дефицит репарации несоответствия при УК у собак и кошек
У части пациентов с MIBC (1,1–7,7%) наблюдается дефицит репарации несоответствия (MMR) [36–39]; таким образом, мы искали доказательства дефицита MMR при УК у собак и кошек. Недавнее исследование с использованием иммуногистохимии белков MMR (MSH2, MSH6 и MLH1) не выявило потери иммуномечения в белках ≥ 1 MMR при УК у собак; однако было исследовано только 15 образцов [40]. В этом исследовании у собаки DD0355 мы идентифицировали соматическую вставку сдвига рамки считывания и делецию сдвига рамки зародышевой линии в MSH2 (p.T234Yfs*22 и p.R1076X соответственно). В образце опухоли DD0194a от другой собаки мы можем предсказать, что имела место биаллельная соматическая инактивация MSH2 посредством мутации сдвига рамки считывания и потери гетерозиготности, поскольку частота аллеля (AF) сдвига рамки считывания составляла 0,87, и эта и 4 другие вышестоящие мутации имеют AF составляет от 0,89 до 0,96 и находится вблизи или в пределах прогнозируемой делеции > 1 Мб. Используя SigFit [41] для соответствия известным мутационным сигнатурам COSMIC [42], мы идентифицировали сигнатуры одноосновных замен SBS1 и SBS6 в опухолях обеих этих собак и SBS21 в DD0194a (рис. 1b); в то время как SBS1 обнаруживается в большинстве раковых и нормальных клеток [43], SBS6 и SBS21 связаны с репарацией дефектного несоответствия (dMMR) и микросателлитной нестабильностью (MSI) [42, 44]. Кроме того, спектры мутаций indel имеют сходство с сигнатурами COSMIC ID2 и ID7 (дополнительный файл 10: рис. S4a), которые связаны с dMMR и MSI. В соответствии с dMMR и MSI, образцы опухолей от обеих собак имели повышенную частоту одиночных мутаций SNV и indel (13,0 и 8,9 мутаций/Mb соответственно) по сравнению с другими образцами собак.
Аналогично, случай у кошек CATD0037a, который имел повышенную частоту мутаций по сравнению с другими образцами кошек в когорте (13,7 мутаций/МБ по сравнению со средним значением 1,1 мутаций/МБ; рис. 2b), имел две мутации, влияющие на MSH2. Мы идентифицировали делецию сдвига рамки считывания в экзоне 10 (p.G508Afs*18) и одно изменение основания, затрагивающее акцепторный сайт сплайсинга интрона 1, что позволяет предположить, что обе аллели были инактивированы. Подбор мутационной сигнатуры выявил мутационную сигнатуру COSMIC SBS1 и сигнатуры, связанные с dMMR и MSI (SBS6 и SBS44), и, в соответствии с dMMR и MSI, в индел-спектре преобладали делеции одной пары оснований в гомополимерных областях длиной более 5 п.о. (рис. 2в). В дополнение к CATD0037a, CATD0050a имел повышенную частоту мутаций SNV и indel (3,8 мутаций/МБ); однако подбор и реконструкция сигнатур не привели к какому-либо существенному сходству с наблюдаемым спектром мутаций, и не было выявлено соматических или зародышевых мутаций в MSH2, MLH1, PMS2 или MSH6. Учитывая, что мы идентифицировали мутации MSH2 и соответствующие мутационные признаки SBS и ID в случаях УК как у кошек, так и у собак с высокой мутационной нагрузкой, мы можем заключить, что эти образцы являются MMR-дефицитными и, как и человеческий MIBC, дефицит MMR играет роль в онкогенезе у разновидность рака мочевого пузыря у собак и кошек.
Характеристика мутационной сигнатуры, связанной с папоротником-орляком
Случаи УК крупного рогатого скота, которые мы секвенировали в этом исследовании, произошли от коров, у которых УК развился после выпаса на пастбищах с папоротником-орляком, что связано с УК у крупного рогатого скота. УК крупного рогатого скота явно отличался от УК собак и кошек, с чрезвычайно высокой частотой мутаций (в среднем 65 мутаций/МБ) и уникальными мутационными сигнатурами. Мутационные спектры SBS бычьего УК выявили преобладание замен Т-нуклеотидов в специфических тринуклеотидных контекстах. Чтобы охарактеризовать лежащий в основе BF-индуцированный мутагенез, мы извлекли мутационные сигнатуры из замен отдельных оснований и профилировали динуклеотидные замены и инделы. На основании согласия (см. «Методы») было установлено, что существовало две сигнатуры SBS, обозначенные как сигнатура BF-A и сигнатура BF-B, и обе были активны во всех 8 образцах бычьего UC (рис. 5a). Не было достоверного совпадения с какими-либо известными мутационными сигнатурами, поскольку наибольшее косинусное сходство между бычьей сигнатурой BF-A и сигнатурой COSMIC или Signal [45] составляло всего 0,49 и 0,63 соответственно, а для бычьей сигнатуры BF-B самый высокий косинусный уровень сходство составило 0,68 и 0,73 соответственно. Визуальное сравнение спектров также подтвердило низкую достоверность совпадений (дополнительный файл 11: рис. S5). Спектры мутаций образцов с самой низкой (BTAUD0029a) и самой высокой (BTAUD0055a) частотой мутаций были реконструированы с использованием этих новых сигнатур, что дало косинусное сходство 0,981 и 0,990 соответственно (рис. 5b,c). Активность (воздействие) Signature BF-A была причиной 49–89% мутаций в 8 образцах крупного рогатого скота (рис. 5d). В Signature BF-A большая часть точковых мутаций относилась к T > C, при этом большинство из них происходило в контексте тринуклеотидов CTC и TTC, T > A в контексте последовательности ATA, CTA или TTA, а также наблюдалось значительное смещение в сторону транскрибируемого гена. цепь (p < 0,01) во всех этих контекстах в двух или более случаях УК крупного рогатого скота (дополнительный файл 12: рис. S6). Ряд мутаций T > G также возник в конкретных контекстах последовательностей (рис. 5a) со значительным смещением цепи транскрипции (p < 0,01; Дополнительный файл 12: рис. S6). Аналогичным образом, новая сигнатура indel, включающая делецию T, была идентифицирована во всех 8 образцах бычьего UC (рис. 5e). Интересно, что большинство делеций T происходило не в гомополимерных сериях, а скорее в контексте тринуклеотидов CTG или CTC (дополнительный файл 13: рис. S7), чего не наблюдается в сигнатурах COSMIC indel. Наконец, хотя вариантов динуклеотидов было гораздо меньше, большинство из них представляли собой TC > CA и TG > GN (рис. 5f); опять же, это не соответствует ни одной известной сигнатуре дублетной замены оснований COSMIC (DBS). Таким образом, существует четкая закономерность замены и удаления Т-нуклеотидов в определенных тринуклеотидных контекстах, и эти сигнатуры не напоминают какие-либо сигнатуры COSMIC или Signal.
Рисунок 5
Мутационные сигнатуры при УК крупного рогатого скота. a При экстракции сигнатуры были идентифицированы две новые сигнатуры одноосновной замены (SBS), обозначенные сигнатурами BF-A и BF-B. Мутационный спектр SBS состоит из 96 типов замен, которые происходят от шести возможных мутаций SBS, каждая из которых имеет 4 возможных основания непосредственно 5′ и 3′. Показаны наблюдаемые и реконструированные спектры мутаций SBS для образцов с самой низкой и самой высокой частотой мутаций BTAUD0029a (b) и BTAU0055a (c) соответственно. d Абсолютная (верхняя панель) и относительная (нижняя панель) доля мутаций, приписываемых сигнатурам BF-A и BF-B, в образцах бычьего УК. e Спектр мутаций indel BTAUD0055a. е Спектр дублетного замещения в BTAUD0055a
Ранее было показано, что при алкилировании ДНК птакилозидом предпочтение отдается адениновым основаниям [33, 46]; поэтому мы затем спросили, является ли воздействие BF или, в частности, PT ответственным за наблюдаемые нами мутационные сигнатуры. Мы получили цельные экстракты BF из свежесобранных листьев BF (дополнительный файл 14: рис. S8), используя два метода: экстракцию ацетоном (BFA) и экстракцию этилацетатом (BFE), и каждый раз обрабатывали клетки мочевого пузыря человека UC KU-19–19. 24 ч в течение 3–14 дней (см. «Методы»). Экстракты BF имели повышенную цитотоксичность в анализах зависимости доза-ответ на химиочувствительность с увеличением количества дней воздействия; таким образом, концентрации IC20 и IC50 экстрактов BF, нанесенных на клетки для мутационного анализа, были разными для каждого момента времени (с более длительным временем воздействия, требующим более низких доз; Дополнительный файл 15: Таблица S7 и Дополнительный файл 16: Таблица S8). Используя мутации, собранные из всех доз экстракта BF и всех временных точек, было проведено извлечение мутационной сигнатуры (см. «Методы»). На основании согласия (см. «Методы») было подсчитано, что две сигнатуры SBS, которые мы обозначили in vitro как сигнатуры BFA-A и BFA-B, были активны в клетках УК человека, обработанных BFA (рис. 6а). Относительная подверженность каждой подписи в каждом отдельном образце показана в Дополнительном файле 15: Таблица S7. Косинусное сходство между наблюдаемыми мутационными спектрами в клетках, обработанных BFA, и мутационными спектрами, реконструированными на основе извлеченных сигнатур для каждой дозы и момента времени, составляло от 0,974 до 0,992. Пример клеток, подвергшихся воздействию BFA в течение 3 дней (при IC50), показан в дополнительном файле 17: рис. S9a. Сигнатуры BFA-A и BFA-B in vitro очень напоминали две сигнатуры SBS, активные в клетках, обработанных BFE (косинусное сходство = 0,94 и 0,98 с сигнатурами BFE-A и BFE-B соответственно; Дополнительный файл 17: Фиг. S9b-c); в дальнейшем обсуждение будет сосредоточено на сигнатурах, идентифицированных в клетках, обработанных BFA. In vitro сигнатура BFA-A не совпадала с уверенностью ни с одной известной мутационной сигнатурой, при этом наибольшее сходство косинуса составляло 0,7 с COSMIC SBS25 и 0,74 с сигналом SBS141 (дополнительный файл 11: рис. S5a). Кроме того, визуальное сравнение мутационных спектров для COSMIC SBS25 и сигнала SBS141 не содержит пиков T > C и T > A в конкретных контекстах последовательностей, которые являются отличительной чертой новой сигнатуры A, наблюдаемой при УК крупного рогатого скота и in vitro. Сигнатура BFA-A имела хорошее сходство с бычьей сигнатурой UC BF-A, которую мы идентифицировали (косинусное сходство = 0,82), с преобладанием Т-мутаций в конкретных тринуклеотидных контекстах (рис. 6a). In vitro Signature BFA-B не напоминал бычий UC Signature BF-B (косинусное сходство = 0,57). Сигнатура BFA-B in vitro имела косинусное сходство от 0,84 до 0,87 с тремя очень разными известными сигнатурами: COSMIC SBS40, Signal SBS18 и Signal SBS167, который помечен как предварительный или не имеющий доказательств (дополнительный файл 11: рис. S5b), что дает некоторую неопределенность относительно того, являются ли какие-либо из них истинными совпадениями. Таким образом, существует хорошее сходство между бычьей сигнатурой UC BF-A и сигнатурой BFA-A in vitro, которая наблюдалась в обработанной экстрактом BF клеточной линии UC человека, и эти сигнатуры не напоминают какие-либо сигнатуры COSMIC или Signal. Число инделов, обнаруженных в клетках, обработанных BFA, колебалось от 108 до 193, и мы не обнаружили склонности к делеции Т в контексте последовательностей CTG или CTC, как мы это делали в случае бычьего УК.
Рисунок 6
Мутационные признаки в клеточных линиях рака мочевого пузыря человека после воздействия экстрактов папоротника-орляка и птакилозида. a Экстракция сигнатуры выявила 2 новые сигнатуры одноосновной замены (SBS), сигнатуры BFA-A и BFA-B в клетках KU-19–19, подвергшихся воздействию цельного экстракта BF (BFA). b Аналогичные сигнатуры, Signature PT-A и PT-B, были идентифицированы в клетках KU-19–19, подвергшихся воздействию очищенного PT. Для сравнения показан бычий Signature BF-A (нижняя панель). c Спектры мутаций SBS через 3 дня (верхняя панель) и 14 дней (нижняя панель) воздействия PT при IC50. d Абсолютная (верхняя панель) и относительная (нижняя панель) доля мутаций, приписываемых сигнатурам PT-A и PT-B, в клетках KU-19–19, подвергшихся воздействию PT. NTC – нетоксичная концентрация; IC20 и IC50 представляют собой 20 и 50%-ную ингибирующую концентрацию (рост клеток) соответственно; d3, d7, d10 и d14 — количество дней. e Наблюдаемые и реконструированные спектры SBS из клеток KU-19–19, подвергнутых воздействию PT в течение 10 дней (IC50), показывающие активность каждой сигнатуры для каждого типа замены. е Спектр мутаций indel, наблюдаемый на 14-й день (IC50) в клетках KU-19–19, подвергшихся воздействию PT. ж Спектр дублетных замен, наблюдаемый на 14-й день (IC50) в клетках KU-19–19, подвергнутых воздействию PT.
Чтобы определить, является ли PT компонентом экстракта BF, главным образом ответственным за мутационные сигнатуры, которые мы выявили в клетках, обработанных экстрактом BF, и в опухолях УК крупного рогатого скота, а также для исследования влияния времени воздействия, мы очистили PT из листьев BF и обработали KU. -19–19 клеток каждые 24 часа в фиксированной концентрации (нетоксичная доза (NTC) — 0,2 мкМ; IC20 — 10 мкМ; и IC50 — 30 мкМ) и собирали клетки через 3–14 дней после первого дня применения. воздействие (см. «Методы»). Извлечение сигнатуры было выполнено (см. «Методы») с использованием мутаций из всех моментов времени и доз PT. На основании согласия (см. «Методы») было подсчитано, что две сигнатуры SBS, которые мы обозначили in vitro как сигнатуры PT-A и PT-B, были активными. Сигнатуры BFA-A и BFA-B in vitro, обнаруженные в клетках, обработанных экстрактом BF, были повторены в клетках, обработанных PT (косинусное сходство = 0,91 по сравнению с PT-A и 0,97 по сравнению с PT-B), что позволяет предположить, что PT действительно было связано с наблюдаемыми сигнатурами. Когда in vitro сигнатуру PT-A сравнивали с бычьей сигнатурой UC BF-A, сходство с бычьей сигнатурой UC BF-A было ниже (косинусное сходство = 0,77); однако сигнатуры имели общие ключевые особенности бычьей сигнатуры BF-A, а именно, мутации T в определенных мутационных контекстах и отсутствие мутаций C (рис. 6a, b и дополнительный файл 17: рис. S9b). Кроме того, профили индел- и дублетных замен в клетках, обработанных PT, отражали профили бычьего УК.
Из известных сигнатур Signature PT-A имела наибольшее косинусное сходство с COSMIC SBS90 (0,75) и Signal SBS90 (0,78). Следует отметить, что, хотя SBS90 и похож на сигнатуру PT-A in vitro в плане общих пиков мутаций T > A в конкретных контекстах последовательностей, в нем отсутствуют характерные мутации T > C, наблюдаемые при УК крупного рогатого скота, а также сигнатуры PT-A и BFA-A in vitro. (Дополнительный файл 11: рис. S5a), поэтому мы пришли к выводу, что подпись PT-A была новой. Подобно сигнатуре BFA-B in vitro, PT-B имеет косинусное сходство с COSMIC SBS40 и две сигнатуры сигнала (косинусное сходство от 0,83 до 0,88), и при визуальном осмотре было неясно, представляет ли какая-либо из сигнатур PT-B (дополнительный файл). 11: Рис. S5b).
Как и в случае с бычьим УК, наблюдалось значительное смещение в сторону генной транскрибируемой цепи для мутаций T > C, T > G и T > A в конкретных тринуклеотидных контекстах (дополнительный файл 18: рис. S10). Смещение цепи наблюдалось в генах с более высокой экспрессией, которые также имели меньшую мутационную нагрузку; это предполагает активность репарации, связанную с транскрипцией, а не повреждение, связанное с транскрипцией. Мы не обнаружили смещения цепи, связанного с репликацией.
Чтобы определить влияние дозы ПТ с течением времени, мы сравнили мутационные спектры для каждого момента времени. При всех дозах PT наблюдалась аналогичная картина: мутационные спектры, наблюдаемые на 3-й день, напоминали сигнатуру PT-B, а после накопления большего количества мутаций спектры на 14-й день напоминали сигнатуру PT-A. Примеры мутационных спектров на 3-й и 14-й день при дозе IC50 показаны на рис. 6c. Действительно, в более ранние моменты времени (дни 3 и 7) Signature PT-B был преимущественно активен, тогда как в более поздние моменты времени (дни 10 и 14) количество мутаций увеличивается за счет активности Signature PT-A (рис. 6г). Косинусное сходство между мутационными спектрами, реконструированными с помощью сигнатур PT-A и PT-B, и наблюдаемыми мутационными спектрами для каждой дозы и момента времени составляло 0,950–0,999. Пример клеток, обработанных PT в течение 10 дней (при IC50), показан на рис. 6e.
Подобно SBS, мутационные спектры инделей в клетках KU-19–19, подвергшихся воздействию PT, показали большее сходство с мутационными спектрами инделей бычьего UC в более поздние моменты времени, с увеличением доли делеций Т, происходящих за пределами гомополимерных серий (Дополнительный файл 19 : Рис. S11). Для клеток, обработанных PT в течение 14 дней (при IC50; рис. 6f), делеция Т была наиболее распространенной инделией, как и при УК крупного рогатого скота. Для делеций размером 1 п.о., происходящих вне гомополимеров, хотя наблюдалось преобладание делеции Т, как это наблюдается при УК крупного рогатого скота, более широкое предпочтение отдавалось контексту последовательности ATN и CTN (дополнительный файл 20: рис. S12), а не преимущественно в Контекст CTG или CTC. Хотя мы не наблюдали явного предпочтения делеций Т в специфичных для последовательности контекстах в клетках, обработанных BFA, это может быть связано с различием в используемых протоколах дозирования (см. «Методы»); в течение более длительных периодов времени для выживания клеток требовались более низкие дозы BFA, тогда как постоянная доза PT в течение различных периодов лечения показала, что только через 14 дней профиль indel в обработанных клетках был аналогичен тому, который был обнаружен при УК крупного рогатого скота. Также согласуется с бычьим УК, было относительно меньше вариантов динуклеотидов, чем SBS и инделы, и большинство из них представляли собой TG > GA (рис. 6g).
Таким образом, мы охарактеризовали уникальную сигнатуру при УК крупного рогатого скота, BF-A, состоящую из мутаций и делеций нуклеотидов Т/А в определенных контекстах мутации, и имеется хорошее сходство новых сигнатур, обнаруженных при УК крупного рогатого скота и в лабораторных условиях. сигнатуры, обнаруженные в клеточных линиях UC, обработанных BF и PT (дополнительный файл 11: рис. S5). Обработка клеточных линий экстрактом BF и очищенным PT привела к очень сходным мутационным сигнатурам, а увеличение количества мутаций с течением времени в клетках, обработанных PT, было преимущественно связано с активностью сигнатуры A, что указывает на то, что PT является первичным мутагеном, связанным с этой сигнатурой.
Варианты предрасположенности зародышевой линии
Поскольку мы секвенировали соответствующие нормальные ткани для каждой опухоли в наших когортах, мы смогли искать предполагаемые патогенные варианты зародышевой линии. Мы сосредоточились на генах с нонсенс-вариантами и вариантами со сдвигом рамки, поскольку эти варианты будут оказывать предсказуемое вредное воздействие на функцию генов. В случаях УК у собак мы выявили нонсенс-варианты в 6 генах и варианты со сдвигом рамки в 27 генах (дополнительный файл 21: Таблица S9). Как обсуждалось выше, мы идентифицировали вариант сдвига рамки зародышевой линии в MSH2 у собаки DD0355; MSH2 был подтвержден как ген риска УК у людей, при этом патогенные варианты зародышевой линии MSH2 наблюдались у 1,4–3,5% пациентов с УК [47, 48]. Кроме того, образцы зародышевой линии DD0191b и DD0281b имели варианты сдвига рамки считывания в NBN, который представляет собой ген умеренной пенетрантности с патогенными или вероятно патогенными вариантами зародышевой линии у 0,5% пациентов с УК [48]. В другом случае УК у собак наблюдалась мутация сдвига рамки зародышевой линии ATM; ATM также считается потенциальным геном предрасположенности к УК у человека [47]. В случаях УК у кошек мы идентифицировали нонсенс-варианты зародышевой линии в 9 генах и варианты сдвига рамки считывания в 10 генах (дополнительный файл 22: Таблица S10). Важно отметить, что вариант сдвига рамки CHEK2 был идентифицирован у одной кошки (CATD0037). Было обнаружено, что у 1% пациентов с MIBC у человека имеются патогенные или вероятно патогенные варианты CHEK2, гена с умеренной пенетрантностью [48]. В случаях УК крупного рогатого скота мы выявили нонсенс-варианты в 9 генах и варианты со сдвигом рамки считывания в 7 генах (дополнительный файл 23: Таблица S11). Однако ранее не сообщалось, что ни один из этих генов не имеет патогенных вариантов у пациентов с УК. Сравнивая виды, мы также отмечаем наличие вариантов потери функции зародышевой линии в SMAD3, POLQ и CBFA2T3 как в случаях УК у собак, так и у кошек, BARD1 в случаях УК у кошек и крупного рогатого скота и TSC2 в случаях УК у собак и крупного рогатого скота. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, являются ли это истинными вариантами предрасположенности к УК, и могут ли какие-либо из этих кандидатов сообщить о предрасположенности человека к MIBC.
Межвидовой сравнительный анализ изменений числа соматических копий
Анализ профилей SCNA образцов UC собак (n = 62), полученных на основе данных секвенирования экзома, выявил существенные хромосомные приросты и потери, наиболее частыми из которых были увеличение числа копий (CN) вдоль хромосом 13, 36 и 38 и потери CN. вдоль хромосом 5, 12 и 19 (дополнительный файл 10: рис. S4b). Эта закономерность аналогична той, которая была выявлена при первичном УК у собак с помощью сравнительной геномной гибридизации массива олигонуклеотидов (oaCGH; n = 31) [49], при которой наиболее преобладали прирост CN хромосом 13 и 36 и потеря хромосомы 19. При УК кошек (n = 21) наиболее частые приросты CN были обнаружены на хромосоме E3, а наиболее частые потери были обнаружены на хромосомах A1 и D4 и части хромосомы A2 (рис. 2d). Из когорты образцов бычьего UC только 3/8 образцов имели профили SCNA, подходящие для анализа CN (BTAUD00029a, BTADU00031c и BTAUD00055a; см. «Методы»); однако стоит отметить скудность структурных вариантов в этих образцах по сравнению с УК человека, собак и кошек: только хромосомные копи-нейтральные LOH одной хромосомы на образец (хромосомы 11, 29 и 7 соответственно) и очень мало фокальные SCNA (дополнительный файл 24: рис. S13). Отсутствие SCNA при УК крупного рогатого скота согласуется с предыдущим наблюдением о том, что существует обратная зависимость между количеством соматических мутаций и SCNAs [50]. Кроме того, PT преимущественно алкилирует адениновые основания [51], что приводит к небольшим аберрациям ДНК, а не к нестабильности генома.
Хромотрипсис наблюдался у человека с MIBC [52], при этом в одном исследовании было выявлено 11/23 (47,8%) образцов УК с событиями хромотрипсиса низкой или высокой достоверности [53]. Используя критерии, описанные Ворониной и соавт. [54] для оценки предрасположенностей к хромотрипсису как высокой, средней и низкой достоверности (см. «Методы»), мы идентифицировали явления, подобные хромотрипсису, в 60% образцов УК собак (37/62), для которых у нас были высококачественные профили SNCA (54). (Дополнительный файл 10: рис. S4c см. «Методы»). Пример образца УК собаки с событиями, подобными хромотрипсису, на двух хромосомах показан в Дополнительном файле 10: Рис. S4d. События, подобные хромотрипсису, чаще всего обнаруживались на хромосоме 36 (n = 10 образцов), за которой следовала хромосома 10 (n = 7), что аналогично тому, что ранее было выявлено при первичном УК у собак с помощью oaCGH [49], где, по оценкам, 74% случаев имело 1 или более хромотрипсис-подобных событий. Были также некоторые заметные различия; например, мы также определили хромосому 9 как частую мишень событий, подобных хромотрипсису, а Shapiro et al. обнаружили в 16% образцов явления, подобные хромотрипсису, на хромосоме 16, чего мы не наблюдали. Эти различия могут быть связаны с различиями в критериях определения хромотрипсисоподобных событий и/или различиями в технологиях, используемых для обнаружения SCNA. Эти события хромотрипсиса могут быть подтверждены путем объединения структурного варианта и анализа CN и выполнения полногеномного секвенирования [53]. Как и в случае с УК собак, мы выявили явления, подобные хромотрипсису, в образцах УК кошек. Из 8/21 (38,1%) образцов с событиями, подобными хромотрипсису, чаще всего поражались хромосомы A2 и E1 (дополнительный файл 25: рис. S14a). Пример образца УК кошек с событиями, подобными хромотрипсису, на 3 хромосомах показан в Дополнительном файле 25: Рис. S14b.
Межвидовое сравнение УК собак, УК кошек и ранее проанализированных человеческих MIBC [22] показало, что в пределах рекуррентно амплифицированных или удаленных хромосом или плеч хромосом в образцах MIBC человека было только три области с генами CGC и синтенией между всеми видами. три вида, включая рекуррентно удаленную область, содержащую супрессоры опухоли APC и ARRDC3 (дополнительный файл 26: таблица S12 и рис. 3b). Затем мы использовали STAC [55] для идентификации значительно амплифицированных и удаленных субхромосомных областей в образцах собак и кошек (см. «Методы») и сравнили их со значимыми SCNA, ранее выявленными в MIBC человека (дополнительный файл 27: таблица S13 и рис. 3b). В фокальных областях размером менее 10 Мб мы обнаружили значительную рецидивирующую амплификацию онкогена MDM2 и делецию гена-супрессора опухоли и репарации ДНК RB1 в образцах собак, что также характерно для MIBC человека [22]. В образцах УК кошек было интересно отметить делецию коактиваторов транскрипции и генов ремоделирования хроматина, CREBBP и NCOR1, поскольку 57/97 (59%) пациентов с УК человека имеют несинонимичные мутации в генах ремоделирования хроматина (включая CREBBP и NCOR1). NCOR1 [56], что позволяет предположить, что аберрации регуляции хроматина могут быть отличительной чертой рака мочевого пузыря [56]. Чтобы идентифицировать дополнительные гены, представляющие интерес, мы расширили межвидовое сравнение до более широких пиковых областей, выявленных с помощью анализов STAC и GISTIC (дополнительный файл 27: таблица S13). Член семейства факторов обмена гуаниновых нуклеотидов ARHGEF10, кандидатный ген-супрессор опухоли (TSG), который снижает экспрессию ARHGEF10 в > 50% клеточных линий УК человека [57], был единственным геном, значительно удаленным у всех трех видов, что еще раз подтверждает тот факт, что ARHGEF10 является важной TSG в Калифорнийском университете.
Таким образом, с помощью WES мы смогли резюмировать профили SCNA собак, наблюдаемые при oaCGH [49], и предложить первое представление о SNCA при УК у кошек и крупного рогатого скота. Хромотрипсис встречается при УК у собак и кошек, что соответствует предыдущим сообщениям о хромотрипсисе при MIBC у человека [52]. Как и в случае с соматическими мутациями, межвидовой анализ позволил идентифицировать общие значительно амплифицированные или удаленные гены, которые являются ключевыми факторами развития рака мочевого пузыря.
Обсуждение
Достижения в секвенировании генома позволили провести комплексную каталогизацию мутаций и событий числа копий при раке. Однако различение мутаций пассажира и водителя остается сложной задачей. Межвидовой анализ — один из методов, который может способствовать улучшению нашего понимания онкогенеза. Во-первых, идентификация SMG или SCNA, общих для разных видов, может помочь расставить приоритеты и уточнить гены-кандидаты-драйверы и потенциально улучшить наше механистическое понимание функции генов рака. Во-вторых, выяснение сходств и различий в онкогеномном ландшафте опухолей у видов, отличных от человека, позволяет нам определить, представляют ли они соответствующие модели, которые можно использовать в качестве средства для улучшения и ускорения нашего понимания биологии рака и потенциальных методов лечения.
У домашних собак и кошек спонтанно развиваются опухоли, которые во многом схожи с опухолями человека, включая анатомическую локализацию, гистологическую картину и терапевтический ответ, и, в частности, собаки были предложены в качестве модели MIBC человека (обзор в [58]). Были изучены транскриптомы небольших когорт собак с УК (от n = 4 до n = 18) [26, 28, 59–62]; тем не менее, только два исследования проводили WES при УК собак, причем их результаты были ограничены небольшим размером выборки и отсутствием соответствующих нормальных тканей (n = 3/11 [28] и n = 0/28 [32] образцов опухолей имели нормальные образцы тканей того же животного). Напротив, полного экзомного анализа УК у кошек не проводилось, что, вероятно, является следствием относительно низкой частоты встречаемости (0,38–0,56% всех злокачественных новообразований у кошек [63, 64] по сравнению с 1,5–2% всех новообразований у собак). [65], а также сравнительно меньшие инвестиции в секвенирование рака у кошек [66]. Поэтому в этом исследовании мы секвенировали экзомы УК собак и кошек, что не только дало представление о УК у этих животных-компаньонов в соответствии с подходом «Одно лекарство, одно здоровье» [67], но также позволило нам идентифицировать консервативные генетические изменения, участвующие в развитии опухолей при MIBC человека, путем использования сравнительного межвидового анализа.
УК собак и кошек генетически гетерогенны, как и MIBC человека, и оба имеют общие аспекты мутационного ландшафта MIBC человека, а также важные различия. Наиболее поразительным сходством была значительная доля образцов с мутациями TP53 как при УК кошек, так и при МИРРМЖ у человека. Однако мы не обнаружили одновременной мутации TP53 и RB1, которая наблюдается при MIBC человека [22]. Мутация TP53 практически отсутствовала при УК собак; однако, как и человеческий MIBC, MDM2, который является негативным регулятором TP53 [68] и RB1 [69], значительно амплифицировался при собачьем УК (рис. 3), а сам RB1 также был значительно удален. Это предполагает, что нарушение пути р53 за счет амплификации MDM2, а не мутации TP53, может быть ключевым фактором онкогенеза при УК у собак. Важно отметить, что RB1 был одним из трех генов, мутация которых, как было обнаружено, предсказывает ответ и пользу от неоадъювантной химиотерапии на основе цисплатина при MIBC у человека [70]. Наиболее поразительным различием между УК собак и MIBC человека была высокая доля опухолей УК собак с мутациями BRAF p.V588E (V595E), что соответствует мутации горячей точки BRAF p.V600E человека. Ранее об этой мутации сообщалось в 65–87% случаев УК у собак [25–28], а тестирование мутации BRAF ДНК в образцах мочи стало неинвазивным методом диагностики УК у собак [71]. Однако BRAF нечасто мутирует при УК и ММРМЖ у человека [22, 72, 73], не мутирует ни в одном из 23 случаев УК у кошек и мутирует только в 1 из 8 случаев УК у крупного рогатого скота, что предполагает иную этиологию онкогенеза у собак.
Хотя подмножество MIBC человека с высокой мутационной нагрузкой связано с признаками активации APOBEC [22], мы не обнаружили повышенной частоты мутаций в случаях УК у кошек или собак, кроме тех, которые связаны с дефицитом MMR. Хотя извлечение сигнатур de novo было ограничено из-за небольшого количества мутаций, доступных для анализа, маловероятно, что сигнатуры мутагенеза, опосредованные APOBEC, присутствуют, учитывая очень низкую частоту мутаций. Тем не менее, выполнение полногеномного секвенирования или сбор гораздо больших наборов данных WES может позволить обнаружить другие сигнатуры, которые способствуют снижению мутационной нагрузки. В одном образце из кошек и в двух образцах из собак наблюдалась повышенная мутационная нагрузка, связанная с MSI/dMMR из-за мутаций с потерей функции в MSH2. MSH2 является признанным геном риска УК у человека [47, 48]; УК является третьей наиболее распространенной опухолью, связанной с синдромом Линча [74], при этом повышенный риск развития УК мочевого пузыря отмечается у пациентов с синдромом Линча, несущих мутации MSH2 [75]. В предыдущих исследованиях сообщалось о MSI у 1,1% пациентов с УК мочевого пузыря [76] и о dMMR у 1,1–7,7% пациентов [36–39]. Дефектный MMR при УК мочевого пузыря демонстрирует временную и пространственную однородность по всей опухоли [37], и существует сильная корреляция с инфильтрацией цитотоксическими Т-лимфоцитами и тканевой экспрессией PD-L1 [36]. Действительно, имеется сообщение о случае, показывающее полный ответ на антитело против PD-L1 (атезолизумаб) у пациента с метастатическим MIBC, у которого был MSI, связанный с новой соматической мутацией MSH4 [77]. Таким образом, не только часть случаев УК у собак и кошек потенциально представляют собой модель УК мочевого пузыря, опосредованного MSI/dMMR, но они сами также могут получить пользу от терапии ингибиторами иммунных контрольных точек.
При высокой частоте мутаций и почти 60 SMG, идентифицированных в MIBC человека [22], трудно идентифицировать истинные гены-драйверы и события-драйверы. Межвидовой сравнительный анализ SMG при УК у собак, кошек и человека позволил уточнить ARID1A, KDM6A, TP53, FAT1 и NRAS как ключевые гены-драйверы при MIBC у человека. Аналогичным образом, хотя соматический анализ CN MIBC человека выявил многочисленные гены в значительно амплифицированных или удаленных хромосомных областях [22], межвидовое сравнение значительных изменений числа копий выявило небольшое перекрытие между UC у трех видов. Это позволило дополнительно уточнить соответствующие изменения CN и идентифицировать ключевые события, определяющие онкогенез у разных видов, включая амплификацию онкогена MDM2, делецию супрессора опухоли RB1 и делецию гена-кандидата-супрессора опухоли ARHGEF10, который был единственным существенно удаленным геном у УК у всех 3 видов. Кроме того, мы определили делецию генов ремоделирования хроматина CREBBP и NCOR1 как частые движущие события при УК у человека и кошек.
Воздействие BF связано с раком пищевода и желудка у людей (обзоры приведены в [78–81]). Воздействие может происходить непосредственно при употреблении в пищу растения или при вдыхании спор, а PT, канцероген, обнаруженный в BF, был обнаружен в молоке коров, пасущихся на BF, а также в поверхностных и грунтовых водах [21, 78, 82, 83]. Было подсчитано, что на долю PT приходится > 50% канцерогенной активности BF [84]. Канцерогенное действие ПТ основано на его гидролизе и образовании диенонового интермедиата (АПТ), который может образовывать аддукты ДНК (путем алкилирования), ответственные за индуцирование карциномы [51]). У крупного рогатого скота обычно не развивается UBC; однако у тех, кто пасся на пастбищах БФ, из-за хронической токсичности БФ может развиться энзоотическая гематурия крупного рогатого скота, что приводит к кровоизлияниям в мочевой пузырь и развитию множественных поражений стенки мочевого пузыря, большинство из которых — УК (67%) [17]. Аддукты ДНК были обнаружены в подвздошной кишке телят, которых кормили BF [33], и в тканях верхних отделов желудочно-кишечного тракта мышей, которых кормили экстрактом или спорами BF [85], что является прямым доказательством канцерогенеза, индуцированного BF.
Секвенирование бычьего УК выявило мутационные профили, значительно отличающиеся от таковых при спонтанном УК, возникающем у кошек, собак и людей. Мы идентифицировали новые мутационные сигнатуры SBS, DBS и indel, которые присутствовали во всех восьми секвенированных нами UC мочевого пузыря крупного рогатого скота, которые возникли у коров, которые паслись на пастбищах с BF в Португалии и Бразилии. В соответствии с предыдущим наблюдением о том, что АТТ преимущественно алкилирует аденины [33, 86], преобладающими признаками УК мочевого пузыря крупного рогатого скота были делеция Т в контексте CTG или CTC и точечная мутация Т в специфических динуклеотидных и тринуклеотидных контекстах. Примечательно, что мы смогли идентифицировать сходные мутационные признаки в линии клеток УК человека, подвергшейся воздействию либо экстрактов BF, либо очищенного РТ, предоставив доказательства того, что воздействие РТ вносило основной вклад в мутационные профили, наблюдаемые при УК крупного рогатого скота. Bovine Signature BF-B не был повторен в экспериментах на клеточной линии человека; это может представлять собой другие мутационные процессы, активные при УК крупного рогатого скота, которые не наблюдались in vitro. Кроме того, вторая сигнатура SBS, извлеченная из экспериментов с клеточной линией УК человека, сигнатура BFA-B, не наблюдалась в УК крупного рогатого скота, что могло быть связано с процессами, происходящими in vitro, или с тем фактом, что популяция клеток не была клональной.
Заключение
Мы определили ключевые сходства и различия между генетическим ландшафтом спонтанно возникающего УК мочевого пузыря у домашних собак и кошек и ММРМЖ у людей. Сходства показывают, что УК как у собак, так и у кошек может быть информативным в качестве модели ММРМЖ человека, что имеет дополнительное преимущество, поскольку дает информацию для дальнейшего изучения УК этих животных-компаньонов, а также ММРМЖ человека. Межвидовой сравнительный анализ был использован для определения приоритетности генов-кандидатов-возбудителей и событий числа копий в MIBC человека, что поможет сосредоточить будущие исследования на вариантах лечения. Наконец, мы выявили у крупного рогатого скота, потребляющего BF, чрезвычайно высокую мутационную нагрузку и новую мутационную сигнатуру, характеризующуюся точечной мутацией и делецией нуклеотидов T/A в конкретных контекстах последовательностей. Повторение этой сигнатуры in vitro в клеточных линиях указывает на то, что PT является мутагеном. Эти результаты могут иметь значение для исследований, изучающих влияние воздействия BF и PT на здоровье людей.
Методы
Сбор образцов и выделение ДНК
Образцы уротелиальной карциномы мочевого пузыря состояли из фиксированных формалином и залитых в парафин (FFPE) тканей собак, кошек и крупного рогатого скота, которые были собраны в рамках рутинных диагностических процедур или вскрытия (или на бойне) с согласия владельца. Использование образцов соответствовало рекомендациям Нагойского протокола. Случаи были отобраны на основе наличия подходящей нормальной (здоровой) ткани FFPE от одного и того же животного (которая в некоторых случаях представляла собой ткань мочевого пузыря, прилегающую к опухоли, а в других случаях вообще представляла собой другую ткань) и из ряда пород и учреждения в разных странах. Страна, из которой был получен случай, ткань, из которой был взят образец, и сигнальные данные для каждого случая, включая вид, образец опухоли и нормальной ткани, породу, пол, статус кастрации и возраст на момент постановки диагноза, представлены в Дополнительном файле 1: Таблица S1. 87 случаев заболевания собак (29 самцов, 58 самок) представляли 36 различных пород и были собраны из 20 институтов в 16 странах. 23 случая заболевания кошек (14 самцов и 9 самок) представляли 6 различных пород и были собраны в 8 различных учреждениях в 8 странах. 8 случаев заболевания крупного рогатого скота (от 7 разных коров, поскольку у одной коровы было 2 независимых поражения) были собраны в 3 различных институтах в 2 странах. Учреждения представляли собой смесь частных компаний, занимающихся ветеринарной патологией, и университетских или государственных кафедр ветеринарной патологии. Все случаи были осмотрены опытными патологами, которые затем аннотировали опухоль и нормальные области, из которых были взяты образцы. Все образцы опухолей и нормальных тканей получали либо в виде кернов диаметром 0,6 или 1 мм, либо в виде неокрашенных срезов ткани толщиной 10 микрон, прикрепленных к предметным стеклам. Геномную ДНК экстрагировали из опухоли и нормальных ядер или неокрашенных срезов тканей (соскобленных с опухоли и нормальных участков на предметных стеклах) с использованием набора тканей QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя.
Цельноэкзомная конструкция приманки
Библиотеки приманок Agilent SureSelect были разработаны для экзомов собак, кошек и крупного рогатого скота с использованием моделей генов из Ensembl v98 и ссылок на геномы CanFam3.1 [87] (OLID: 3263651, 3263641, 3263631), Felis_catus_9.0 [88] (OLID: 3261601) , 3261611, 3261621) и ARS-UCD1.2 [89] (OLID: 3263141, 3263131, 3263121) соответственно. Приманки были разработаны против областей в транскриптах, кодирующих белок, аннотированных на основных аутосомах и хромосоме X, с дополнительными 25 п.н., фланкирующими каждую сторону. В окончательном дизайне приманки 7,4, 5,1 и 7,2% исходных целевых кодирующих регионов собак, кошек и крупного рогатого скота не имели покрытия приманкой. Сбалансированное усиление приманки применялось для регионов с высоким GC.
Секвенирование, выравнивание считываний и контроль качества
Библиотеки секвенирования были приготовлены из ДНК, экстрагированной FFPE, как описано ранее [90], объединены (8-плексы) эквимолярным способом и гибридизованы с приманками в течение ночи. Мультиплексированные образцы секвенировали попарно-концево с использованием платформы NovaSeq (Illumina) для создания считываний длиной 101 п.н.
Считывания секвенирования образцов собак, кошек и крупного рогатого скота были сопоставлены с эталонными геномами CanFam3.1, Felis_Catus_9.0 и ARS-UCD1.2 соответственно с использованием BWA-MEM (v0.7.17-r1188) [91]. Дубликаты ПЦР были помечены с использованием дубликатов bammarkduplicates Biobambam2 (v2.0.29) [92]. Образцы с загрязнением, заменой образцов и охватом менее 11x в 80% целевых регионов были исключены. Также были исключены опухоли собак и кошек, у которых 95% ВАФ от вызова соматических мутаций составляли ≤ 0,25. В общей сложности было 87 собак, 23 кошки и 8 бычьих пар опухоль-нормальная. Среднее покрытие последовательностей целевых областей составляло 123x, 113x и 86x для этих образцов собак, кошек и крупного рогатого скота, соответственно, если были исключены дубликаты ПЦР.
Вариант вызова
Соматические SNV идентифицировали с помощью MuTect (v1.7) [93]. Использовались параметры по умолчанию, за исключением минимального базового показателя качества, равного 30, и максимум трех альтернативных аллелей, разрешенных в соответствующем нормальном образце. MAC (v1.2) [94] использовался для идентификации многонуклеотидных вариантов на выходе MuTect путем идентификации соседних SNV на одной и той же цепи. Strelka2 (v2.9.10) [95] использовалась для идентификации небольших делений с использованием параметров по умолчанию с отключенной опцией оценки эмпирических вариантов (EVS). Генные модели и Variant Effect Predictor (VEP) [96] от Ensembl v98 использовались для прогнозирования последствий изменений оснований и инделей в белках. Канонический транскрипт, определенный Ensembl, использовался для определения последствий варианта. Распространенные SNV, определяемые как варианты, присутствующие в 1% или более справочных базах данных SNV, перечисленных ниже, были удалены. Мы идентифицировали артефакты перехода C > T в результате дезаминирования цитозина, присутствующие при низкой частоте аллелей вариантов (VAF), и попытались удалить их, удалив C > T (или G > A) с помощью VAF < 0,1, общая глубина покрытия < 20x или VAF < 0,2, если покрытие было 20-99х. Мы также идентифицировали артефакты со схожими мутационными профилями, такие как COSMIC сигнатуры SBS45 и SBS52, и поэтому удалили трансверсии C > A (или G > T), которые произошли в контексте последовательности CCN или TCN (NGG или NGA для G > Ts), если VAF был < 0,1, глубина покрытия была менее 20, или покрытие составляло 20-99x и VAF была < 0,2. Кроме того, применялась общая фильтрация и варианты удалялись, если опухоль или соответствующая нормальная глубина покрытия составляла < 10x , если покрытие < 300x и VAF в опухоли составляло < 0,1 или если покрытие ≥ 300x и VAF в опухоли составляло < 0,05. Кроме того, VAF в подобранной норме должен был составлять < 0,01. DISCOVER (v.0.9.4) [31] использовался для поиска взаимоисключающих и одновременно встречающихся соматических мутаций.
Каталоги известных вариантов геномов кошек, собак и коров были получены от Консорциума 99 Lives Cat Genome Consortium (v9, из 54 геномов кошек) [88], Национального института исследований генома человека (NHGRI) Dog Genome Project [97], и проект «1000 геномов быков» [98] соответственно. VAF из этих баз данных использовались для удаления любых распространенных вариантов (AF ≥ 0,01) из вызовов соматических вариантов. Варианты в образцах нормальной зародышевой линии были идентифицированы с использованием набора инструментов для анализа генома (GATK, v4.2.4.1) [99]. GATK HaplotypeCaller запускался с минимальным базовым показателем качества 20, и мягкие отсеченные основания не использовались. За этим последовали JointGVCF, GenotypeGVCF и SelectVariants, чтобы создать файл для SNV и еще один для indels. Наконец, была запущена GATK VariantFiltration со следующими параметрами для SNV: QC < 2, QUAL < 30, SOR > 3, FS > 60, MQ < 40, MQRankSum < -12.5, ReadPosRankSum < -8.0. Для инделей варианты были следующие: QD < 2, QUAL < 30, FS > 200, ReadPosRankSum < -20. Ensembl VEP был запущен, как описано выше, для прогнозирования различных последствий. Для идентификации аллелей-кандидатов риска в зародышевых линиях собак, кошек и крупного рогатого скота были удалены варианты с частотой популяционного аллеля (AF) > 0,001 в соответствующих базах данных вариантов (описанных выше), а также многоаллельные сайты и сайты, где более половина образцов не была генотипирована. Наконец, мы выбрали варианты, приводящие к сдвигу рамки и бессмысленным мутациям в генах, которые имели ортологию один к одному с геном CGC.
Изменения числа соматических копий
Sequenza (v3.0.0) [100] использовалась для идентификации аллель-специфичных SCNA из выровненной опухоли и соответствующих нормальных последовательностей (описанных выше). Все результаты обрабатывались вручную, и, где это применимо, использовались альтернативные оценки плоидности и чистоты для замены наиболее подходящих решений по умолчанию, как описано ранее [100]. Хотя Sequenza не предоставляет конкретных измерений для оценки шума и качества оценок, для этой цели предусмотрены различные графики. Ручное курирование включало визуальную проверку графиков подгонки модели, которые показывают корреляцию частот B-аллелей (BAF) и отношений глубины с плотностью логарифмической апостериорной вероятности (LPP), контурного графика, который показывает LPP диапазона плоидности и комбинации чистоты, а также графики генома, показывающие соотношение BAF и глубины, как описано в дополнительных материалах Favero et al. [100]. Образцы, которые, как считалось, имели чрезмерный шум, были исключены из анализа CN. Sequenza обеспечивает запрос абсолютного числа копий для сегментов, поэтому, чтобы определить, представляет ли сегмент относительное увеличение или потерю CN, плоидность опухоли сначала определялась как наиболее частый CN, присвоенный сегментам со средними частотами B-аллелей > 0,3 и CN выигрышем или убытком называли, если абсолютное КЧ сегмента было выше или ниже плоидности соответственно. STAC [55] использовался для обнаружения значительных приростов и потерь CN в образцах собак и кошек. Области усиления или потери с p-значением частоты < 0,05 или p-значением зоны охвата < 0,05 считались статистически значимыми. Получение значений p-частоты и следа описано в публикации STAC [55].
Значительно мутированные гены
Для идентификации генов-кандидатов-драйверов мы использовали dNdScv (v0.0.1.0, git commit ID 0633182) [101], который идентифицирует гены при положительном отборе, и MuSiC2 [102], который использует несколько статистических тестов для выявления генов, значительно мутировавших выше фоновая частота мутаций. Справочные базы данных dNdScv для каждого вида были созданы с использованием канонических транскриптов Ensembl v98, и в них были включены только гены, предназначенные для разработки приманок. Гены со значением q < 0,01 при рассмотрении только замен или всех типов мутаций считались значимыми. Для анализа MuSiC2 гены с FDR < 0,01 по результатам теста свертки считались значимыми. Тест свертки описан в оригинальной публикации MuSiC [102].
Признаки соматических мутаций
Для образцов УК собак и кошек с повышенным уровнем мутаций использовался SigFit (v2.2) [41] для подбора мутационных сигнатур COSMIC (v3.2). Используя мутационные возможности, рассчитанные на основе экзома собаки или кошки, включая экзоны плюс 2 п.о., фланкирующие каждый экзон, для учета сайтов сплайсинга, количество каталогов мутаций было преобразовано относительно генома человека. Затем функция SigFit fit_signatures использовалась для подбора сигнатур COSMIC (v3.2) с использованием 10 000 итераций выборки. Для переоснащения сигнатур использовались сигнатуры, вызывающие более 5% мутаций, а лучшим решением была выбрана комбинация сигнатур, которая привела к наибольшему косинусному сходству после реконструкции спектров мутаций.
Для образцов бычьего УК SigFit (v2.2) [41] использовался для извлечения мутационных сигнатур de novo путем предварительного преобразования количества каталогов мутаций относительно человеческого генома с использованием мутационных возможностей, рассчитанных на основе бычьего экзома плюс 2 п.о., фланкирующих каждый экзон. Извлечение сигнатур было выполнено с использованием 10 000 итераций выборки, а график согласия был создан с использованием функций SigFit «calculate_gof» и «plot_gof» для оценки оптимального количества подписей. Затем была выполнена повторная подгонка сигнатур с использованием извлеченных сигнатур для расчета экспозиции сигнатур на образец. Извлечение сигнатуры было выполнено таким же образом для каталогов мутаций из собачьего и кошачьего УК, преобразуя количество мутаций относительно человеческого генома с использованием мутационных возможностей, рассчитанных на основе экзома собачьего и кошачьего плюс 2 п.о., фланкирующих каждый экзон. Извлечение сигнатур осуществляли для каталогов мутаций из клеток мочевого пузыря человека, как описано выше, без преобразования количества каталогов. Все новые сигнатуры сравнивались с сигнатурами COSMIC (v3.2) [42] и эталонными сигнатурами Signal [45] SBS (v2.03; https://github.com/Nik-Zainal-Group/signature.tools.lib/tree). /master/data/RefSigSBS_v2.03).
SigProfilerMatrixGenerator (v1.2.9; [103]) использовался для подсчета количества мутаций в транскрибируемых и нетранскрибируемых цепях гена, а точный критерий Пуассона использовался для расчета значительной систематической ошибки цепи для каждого типа мутации. Впервые был установлен геном крупного рогатого скота ARS-UCD1.2 с изменением, внесенным в сценарий SigProfilerMatrixGenerator «save_chrom_tsb_separate.py», чтобы включить список хромосом генома крупного рогатого скота. Были использованы канонические транскрипты из Ensembl v98 и список интервалов экзома.
Хромотрипсис
Мы использовали определение и оценку хромотрипсиса, как описано в Vorinina et al. [54] для оценки степени этих явлений в опухолях собак и кошек на основе результатов сегментации Sequenza CN (см. выше). Области, положительные по хромотрипсису, определялись как высокая достоверность (10 или более переключений состояний CN в 50 Мб), промежуточная достоверность (8 или 9 переключений состояний CN в 50 Мб) или низкая достоверность (6–7 переключений состояний CN в 50 Мб). В случае положительного результата хромотрипсис далее классифицировали как канонический (2 или 3 состояния CN) или неканонический (> 3 состояния CN). Для хромосом < 50 Мб количество необходимых переключений состояний CN масштабировали соответствующим образом и округляли до ближайшего целого числа. Например, если размер хромосомы составляет 30 МБ, коэффициент масштабирования 0,6 (30/50 МБ) применялся к определениям высокой достоверности (6 или более переключений состояний CN), промежуточной достоверности (5 переключений состояний CN) и области низкой достоверности (4 переключения состояния CN) хромотрипсиса.
Данные о раке мочевого пузыря человека
Данные о мутациях из исследования рака мочевого пузыря человека TCGA [22] были загружены с веб-сайта исследования cBioPortal (https://www.cbioportal.org/study/summary?id=blca_tcga_pub_2017). Файлы сегментации того же исследования были доступны на портале данных Международного консорциума генома рака (ICGC) (https://dcc.icgc.org/) [104] для 278 доноров; поскольку нас интересовало только сравнение первичных опухолей, из нашего анализа была исключена 1 метастатическая опухоль. Эталонным геномом для исследования был GRCh37.
Межвидовое сравнение
Ортологичные гены и синтенные области между генами и геномами человека, собаки, кошки и быка были загружены из Ensembl v98 [105]. Для межвидовых сравнений были включены только гены с ортологичными отношениями один к одному. Гены Cancer Gene Consensus (v96) были загружены с веб-сайта COSMIC (https://cancer.sanger.ac.uk/census) [106].
Экстракт папоротника-орляка и очистка птакилозида
Свежие, развернувшиеся листья папоротника-орляка (скрипача), Pteridium aquilinum (L.) Khun. (Dennstaedtiaceae) были собраны в начале вегетационного периода (середина-конец мая) в Бэйлдон-Мур, Брэдфорд, Западный Йоркшир, Великобритания, и обработаны в течение нескольких часов, как сообщалось ранее [107]. Вкратце, головы скрипачей замораживали жидким азотом, измельчали в порошок и мацерировали ацетоном. Отфильтрованный экстракт сушили под N2, а затем под вакуумом, чтобы получить ацетоновый экстракт, используемый (BFA) для исследований цитотоксичности. Этилацетатный экстракт (BFE) получали путем концентрирования ацетонового экстракта при пониженном давлении и температуре 30°C, разбавления водой и распределения несколько раз с этилацетатом. Экстракт концентрировали при пониженном давлении и температуре 40°С, затем сушили в вакууме. Птакилозид (ПТ) выделяли из этилацетатного экстракта методом колоночной хроматографии низкого давления на силикагеле, как сообщалось ранее [107].
Клеточная культура и химиочувствительность
KU-19–19 (RRID: CVCL_1344) представляют собой линию клеток уротелиальной карциномы (UC) мочевого пузыря человека [108] с низкой или отсутствующей собственной активностью APOBEC [109]. Используемые клетки были аутентифицированы как KU-19–19 с помощью STR-профилирования и подтверждены как свободные от микоплазмы [110]. Клетки поддерживали при низком пассаже в среде RPMI-1640, не содержащей антибиотиков (Sigma, R0883), с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 2 мМ L-глутамина. Химиочувствительность клеток КУ-19–19 к очищенным БФА/БФЭ и ПТ определяли методом МТТ [111] после непрерывного ежедневного воздействия на клетки в течение 3, 7, 10 и 14 дней (двукратное серийное разведение БФА/БФЭ от 79,7 мкг/г) до 0,156 мкг/мл и двукратное серийное разведение ПТ от 100 мкМ до 195 нМ). Клетки KU-19–19 высевали в 96-луночные планшеты для культивирования клеток по 1000 клеток на лунку в 200 мкл среды и инкубировали в течение 24 часов при 37 °C перед воздействием BFA/BFE или PT. BFA/BFE или PT в необходимых для тестирования концентрациях готовили свежеприготовленными каждый день непосредственно перед использованием путем разведения в среде для культивирования клеток RPMI-1640 исходных растворов в ДМСО, которые хранили в аликвотах для одноразового использования при температуре - 20 °C. Все клетки подвергались воздействию конечной концентрации ДМСО 0,1% с процентным ингибированием роста клеток при каждой тестируемой концентрации BFA/BFE или PT, определяемой относительно клеток, обработанных «контрольным носителем» (0,1% ДМСО). Каждый день обработки клеток вплоть до дня анализа МТТ среду осторожно удаляли из лунок и заменяли свежей культуральной средой, содержащей свежеразведенный BFA/BFE или PT, или растворитель. Для анализа МТТ среду удаляли и в лунки добавляли свежую среду, содержащую МТТ (0,5 мг/мл), а клетки дополнительно инкубировали при 37 °C в течение 4 часов, чтобы дать возможность образоваться кристаллам формазана. Кристаллы растворяли в ДМСО и показания оптической плотности при 540 нм использовали для построения кривых «доза-эффект» для определения концентраций IC20 и IC50 [111].
Обработка клеток KU-19–19 экстрактами папоротника-орляка или очищенным птакилозидом для мутационного анализа
Для секвенирования ДНК после обработки клеток KU-19–19 BFA, BFE или PT эксперименты были масштабированы с 96-луночных планшетов до культуральных колб площадью 25 см2. Клетки KU-19–19 высевали в количестве 7,8×104 клеток на колбу Т25 в 5 мл полной среды RPMI-1640 за 24 часа до обработки. В экспериментах с BFA/BFE клетки KU-19–19 обрабатывали ежедневно в течение 3, 7, 10 и 14 дней путем замены среды свежеразбавленными BFA/BFE при их концентрациях IC50 и IC20 в каждый момент времени, как заранее определяли МТТ-химиочувствительность. Реакция на дозу химиочувствительности показала изменение их концентраций IC50 и IC20 в зависимости от количества дней обработки клеток, а используемые концентрации находились в диапазоне от 3,1 до 79,7 мкг/мл. В экспериментах с PT клетки KU-19–19 обрабатывали ежедневно в течение 3, 7, 10 и 14 дней путем замены среды на свежеразведенный PT в фиксированной концентрации 30 мкМ (средняя концентрация IC50 для этих моментов времени, определенная по химиочувствительности МТТ) (кривые «доза-эффект»), или 10 мкМ (приблизительная концентрация IC20) или 0,2 мкМ («нецитотоксичная» концентрация). В обоих экспериментах в качестве контроля для каждого момента времени использовались образцы, подвергшиеся воздействию растворителя (обозначенные цифрой «0» в названии образца, чтобы указать, что они не подвергались воздействию BFA, BFE или PT). В конце лечения в обоих экспериментах клетки собирали из колб путем трипсинизации, а клеточные осадки дважды промывали PBS для удаления среды, содержащей сыворотку, а затем «сухие» клеточные осадки мгновенно замораживали в жидком азоте. Геномную ДНК экстрагировали из клеточных осадок с помощью набора Purgene Cell Kit (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя.
Секвенирование, выравнивание считываний и определение вариантов обработанных клеток KU-19–19.
Библиотеки NanoSeq готовили из ДНК KU-19–19 по протоколу дуплексного секвенирования, как описано ранее [112]. Для амплификации и секвенирования было взято разведение 0,2 фмоль для амплификации и секвенирования с охватом 15x (x: эквиваленты гаплоидного генома человека) с использованием парных концевых считываний длиной 150 пар оснований на NovaSeq 6000. Контрольные образцы (KU_PTA_0_d3, d7, d10 и d14) были секвенированы из эти библиотеки путем амплификации 5 фмоль и секвенирования до 15-кратного покрытия. Считывания секвенирования были приведены в соответствие с эталонным геномом человека (GRCh38, включая приманки и HLA) с использованием BWA-MEM (v0.7.17) [91] и обработка данных проводилась, как описано ранее [112]. Вариантный вызов был выполнен с помощью конвейера NanoSeq версии 2 (24 марта, https://github.com/cancerit/NanoSeq) с использованием следующих параметров: -a 50 -b 0 -c 0 -d 2 -f 0.9 -i 0.2 -m 8 -n 3 -p 0 -q 60 -r 144 -v 0,01 -x 8 -z 15. Для каждого момента времени обработанный образец сравнивали с необработанным контролем (KU_PTA_0) из соответствующего момента времени. Извлечение мутационной сигнатуры проводили, как описано выше.