Kevin Marley, Justine Gullaba, Bernard Seguin, Howard B. Gelberg, Stuart C. Helfand
Источник: https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4562978/
Перевод: Е. С. Сергеева
Абстракт
Данное исследование было направлено на выяснение взаимосвязи между метастатическим поведением, индуцированным фактором роста гепатоцитов (HGF), и ингибиторами тирозинкиназы (ИТК) кризотинибом и дазатинибом при остеосаркоме (ОС) собак. Описаны предварительные доказательства очевидной клинической пользы адъювантной терапии дазатинибом у четырех собак. Методы: Ингибиторы оценивали на предмет их способности блокировать фосфорилирование МЕТ; уменьшить HGF-индуцированное производство матриксной металлопротеиназы (MMP); и предотвращать инвазию, миграцию и жизнеспособность клеток в клеточных линиях ОС собак. Пероральный дазатиниб (0,75 мг/кг) был протестирован в качестве адъювантной терапии у четырех собак с ОС. Результаты: Конститутивное фосфорилирование MET было обнаружено в двухклеточных линиях, и на него не влияла инкубация с 20 нМ ни с дазатинибом, ни с кризотинибом. Инкубация клеточных линий с HGF (лигандом MET) увеличивала миграцию и инвазию клеток в обеих клеточных линиях и повышала активность MMP-9 в одной. Дазатиниб подавлял жизнеспособность клеток OS и HGF-индуцированную инвазию и миграцию, тогда как кризотиниб снижал миграцию и продукцию MMP-9, но не ингибировал инвазию или жизнеспособность. Выводы: Экзогенный HGF увеличивает инвазию, миграцию и жизнеспособность клеточных линий ОС собак. HGF индуцирует секрецию разных форм ММП в разных клеточных линиях. Наблюдаемое нами увеличение жизнеспособности и метастатического поведения, вызванное HGF, более равномерно ингибируется дазатинибом. Эти наблюдения предполагают потенциальную клиническую пользу адъювантного лечения дазатинибом у собак с ОС.
Введение
Рецепторная тирозинкиназа (RTK) MET считается фактором роста и подвижности, поскольку она обеспечивает важные сигналы для выживания и миграции во время эмбриогенеза [1]. Передача сигналов MET обычно инициируется связыванием его лиганда, фактора роста гепатоцитов (HGF, также известного как фактор рассеяния), но может конститутивно активироваться вследствие точечных мутаций, коэкспрессии с HGF в той же ткани или сверхэкспрессии [2]. Дерегуляция МЕТ связана с трансформацией и метастатическим прогрессированием при многих видах рака, и это привело к исследованию пути МЕТ как терапевтической мишени [3,4]. Стратегии анти-МЕТ были исследованы с использованием антител [5], рецепторов-ловушек [6] и различных ингибиторов тирозинкиназы (ИТК) [7–10].
МЕТ экспрессируется в различных тканях, включая опухоли остеосаркомы (ОС) собак и клеточные линии [11]. MET-специфичный TKI кризотиниб при тестировании на клеточных линиях ОС человека оказался способен избирательно индуцировать апоптоз, ингибировать рост клеток in vitro и предотвращать рост опухоли на модели ксенотрансплантата мышей [10]. Сверхэкспрессия и коэкспрессия MET и HGF при ОС собак предполагают аутокринную или паракринную активацию и указывают на то, что MET может быть важной мишенью в этом новообразовании [12,13]. В связи с этим короткая интерферирующая РНК против MET снижает подвижность и инвазию in vitro[13]; но MET-специфичный TKI, PHA-665752, не влиял на жизнеспособность клеток ОС собак, экспрессирующих высокие уровни MET [13]. Это предполагает, что путь MET в некоторых случаях может действовать независимо от тех, которые модулируют выживание клеток; и это может быть важно для изучения метастатического поведения опухолевых клеток.
Метастатические опухолевые клетки, возможно, перехватили путь MET, чтобы увеличить их способность проникать в окружающие ткани [14]. Этот сложный процесс, вероятно, включает скоординированные изменения в передаче сигналов между клетками, индукцию независимости от контактов и выработку протеаз, таких как матриксная металлопротеиназа, которые разрушают внеклеточный матрикс [15]. В текущем исследовании путь MET был исследован у собак с OS в контексте инвазивного поведения, включая активность матриксной металлопротеиназы (MMP), индуцированную экзогенным HGF. ИТК кризотиниб и дазатиниб были протестированы на их способность снижать жизнеспособность клеток, предотвращать инвазию и миграцию и блокировать активность ММП в присутствии и в отсутствие HGF. Кроме того, наша предыдущая работа определила дазатиниб как потенциальное средство лечения ОС у собак [16]. Хотя МЕТ не был идентифицирован как специфическая мишень дазатиниба, сообщалось, что дазатиниб блокирует инвазию, миграцию и пролиферацию в различных клеточных линиях саркомы человека, включая ОС [17]. Здесь мы сообщаем об очевидном увеличении выживаемости группы из четырех собак с ОС, которых лечили дазатинибом.
Методы
Клеточные линии и реагенты
В данном исследовании были использованы две клеточные линии ОС собак, COS [18] и Clone-4, разработанные в нашей лаборатории (BS). Клетки культивировали при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO2. Среда для культивирования клеток представляла собой RPMI 1640, дополненную 2 мМ глютамина, 2 мМ пирувата натрия, 2 мМ HEPES, 1% пенициллин-стрептомицина и 10% FBS, далее обозначаемых как R10. Бессывороточная среда, обозначаемая как R0, была идентична, за исключением того, что она не содержала FBS. Рекомбинантный бакуловирус собачьего HGF (rcHGF) был приобретен у R&D Systems (Миннеаполис, Миннесота). Клетки отделяли с помощью 0,25% раствора трипсина и 0,03% раствора ЭДТА и перед использованием подсчитывали на гемоцитометре для оценки количества клеток.
Анализ вторжения
Исследования инвазии проводили с использованием камер Matrigel Invasion Chambers (BD Biosciences, Бедфорд, Массачусетс) с размером пор 8 мкм и уменьшенным фактором роста в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, клетки высевали с плотностью 25000/лунку в верхнюю камеру в среде R0. Нижние камеры содержали среду R10. При необходимости HGF или TKI добавляли как в верхнюю, так и в нижнюю камеры, поэтому единственной разницей между верхней и нижней камерами было 10% сыворотки. Через 24 часа мембраны удаляли, окрашивали Diff Quik, помещали на предметные стекла и визуализировали под микроскопом. Подсчитывали все клетки, мигрировавшие через каждую мембрану, и каждый эксперимент повторяли не менее двух раз.
Миграционный анализ
Клетки высевали в шестилуночные планшеты (2 × 105 клеток/лунку) в 2 мл среды R10 и оставляли прилипать на ночь. На следующий день среду R10 заменяли на R0; и клетки снова инкубировали в течение ночи. Через 24 часа среду удаляли и заменяли, как описано на каждой фигуре; и стерильным наконечником пипетки нацарапали две пересекающиеся линии в крестообразной конфигурации на субконфлюэнтных клетках. Пластины немедленно визуализировали с помощью микроскопа с прикрепленной цифровой камерой (Nikon Eclipse ti). Через 20 часов поцарапанные участки были снова визуализированы; а клетки, мигрировавшие в ранее чистые зоны, подсчитывали вручную. Для выполнения этой задачи на каждое изображение с помощью программного обеспечения для обработки фотографий (Adobe Photoshop) накладывались прямоугольники одинакового размера; и все клетки внутри них были подсчитаны. Штриховка использовалась для размещения ячейки подсчета в одном и том же месте для каждого условия. Каждый из этих анализов повторяли как минимум дважды, и данные представляют собой среднее значение двух независимых анализов.
Витальное окрашивание
Клетки, подготовленные, как описано для анализа миграции (выше), инкубировали с 0-40 нМ дазатиниба в течение 24 часов, а затем трипсинизировали, подвергали воздействию трипанового синего и подсчитывали в гемоцитометре. Клетки, имевшие темно-синий цвет, считались мертвыми. Инкубационную среду добавляли обратно к трипсинизированным клеткам перед подсчетом, чтобы учесть плавающие клетки. Представленные данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение двух независимых экспериментов.
Жизнеспособность клеток
Клетки высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 5000 клеток/лунку в объеме 100 мкл R10 и оставляли прилипать на ночь. На следующий день среду R10 заменяли на R0; и клетки снова инкубировали в течение ночи. Затем среду заменяли свежей средой R0, содержащей различные концентрации TKI плюс или минус 20 нг/мл HGF. Жизнеспособность клеток оценивали через 48 часов с использованием анализа 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолия (МТС) в соответствии с рекомендациями производителя. инструкцию (Промега, #G3580). Все данные выражены как средние значения ± стандартное отклонение для трех повторных лунок и являются репрезентативными для трех независимых экспериментов.
Проточной цитометрии
Проточную цитометрию использовали для обнаружения связывания аннексина V с фосфотидилсерином на поверхности клеток на раннем апоптозе и йодида пропидия с ДНК на поздней стадии апоптоза или в мертвых клетках. Клетки голодали в сыворотке в течение ночи в среде R0, затем инкубировали в той же среде с 0 или 20 нМ дазатиниба ± HGF (20 нг/мл) в течение 24 часов. После инкубации собирали среду и собирали клетки, используя 0,005% трипсин в PBS. Инкубационная среда, содержащая клетки, которые были освобождены из колбы, затем добавлялась обратно к трипсинизированным клеткам вместе с аликвотой сыворотки объемом 100 мкл для остановки действия трипсина. Затем клетки подвергали взаимодействию с биотинилированным аннексином V-FITC и йодидом пропидия с использованием коммерчески доступного набора (Calbiochem). Минимум 20 000 клеток на образец собирали на проточном цитометре Beckman Coulter FC-500. Анализ данных и программная компенсация проводились с использованием WinList (Verity Software, Topsham, ME). Интенсивность флуоресценции аннексина V (FITC) и йодида пропидия регулирулась по прямому и боковому рассеянию, чтобы исключить клеточный мусор. Спектральное перекрытие компенсировали с помощью контроля с одним окрашиванием.
Вестерн-блоттинг
Клетки высевали (3 × 106/лунка) во флаконы площадью 25 см2 и оставляли прилипать на ночь перед инкубацией с дазатинибом или кризотинибом в присутствии или в отсутствие HGF. В конце инкубационного периода среду и клетки удаляли с помощью скребка для клеток; и клетки осаждали в настольной центрифуге (3 минуты, 450 g). Супернатанты отбрасывали, а осадки клеток экстрагировали в 50-мкл ледяного буфера для радиоиммунопреципитации с добавлением коктейля ингибиторов протеаз и фосфатаз (Thermo Scientific, Рокфорд, Иллинойс). Экстракты обрабатывали ультразвуком 4 × 1 секунду с использованием ультразвукового дисмембранатора (Fisher, модель 150T) и гранулировали при массе 10 000 г для удаления клеточного мусора. Концентрацию белка измеряли с использованием анализа Брэдфорда (Пирс, Рокфорд, Иллинойс). Белки (20 мкг/дорожка) разделяли на полиакриламидных гелях с содержанием от 4% до 12% SDS и переносили на мембраны из поливинилидендифторида с использованием следующих стандартных методов. Мембраны блокировали в 2,5% альбумине и реагировали с указанными первичными антителами, разведенными 500:1, в течение 3 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4°С. Используемое антитело фосфо-Met (Y1230/Y1234/Y1235) представляло собой кроличье поликлональное антитело, приобретенное у Millipore (Биллерика, Массачусетс). Тотальные антитела к MET и актину были приобретены у компании Santa Cruz Biotechnology (Санта-Круз, Калифорния). Мембраны промывали, вводили в реакцию со вторичным антителом, связанным с пероксидазой хрена (Santa Cruz Biotechnology), разведенным в соотношении 30 000:1, и подвергали воздействию субстрата (GE Healthcare).
Зимография
Клетки высевали с плотностью 3000 клеток/лунку в 24-луночные планшеты и оставляли прилипать на ночь. На следующий день растущие клетки голодали в сыворотке в течение 24 часов, а затем инкубировали в течение 24 часов в 500 мкл среды R0 плюс или минус любой TKI в концентрации 20 нМ плюс или минус HGF (20 нг/мл). После инкубации аликвоту среды удаляли и центрифугировали при 10 000 g в течение 10 минут для удаления остатков. Аликвоту каждого из них объемом 10 мкл разделяли электрофорезом на 10% полиакриламидно-желатиновых гелях зимограммы в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). После электрофореза гели инкубировали в проявляющем растворе в течение 20 часов при 37°C, окрашивали кумасси синим (G-BioSciences, Сент-Луис, Миссури) и визуализировали с помощью цифровой камеры (LAS 4000; GE Healthcare, Бакингемшир, Великобритания). Денситометрию этих изображений и изображений вестерн-блоттинга проводили с использованием программного обеспечения Image Quant TL (GE Healthcare).
Гистопатология
Биоптаты проксимального отдела большеберцовой кости декальцифицировали, делали срезы и окрашивали гематоксилином и эозином с использованием стандартных методов.
Статистика
Статистические сравнения с использованием дисперсионного анализа с апостериорными тестами Тьюки проводились, когда это необходимо, с использованием программного обеспечения Graphpad Prism (Ла-Хойя, Калифорния). Нелинейную регрессию с использованием логарифмически преобразованных значений использовали для расчета IC50 по результатам анализа MTS с использованием того же программного обеспечения.
Полученные результаты
Миграция/Вторжение
HGF вызывал увеличение миграции в клетках ОС собак, лишенных сыворотки (P ≤ 0,05, рисунок 1), а инкубация TKI в низкой концентрации (20 нМ) подавляла миграцию в клетках COS, но не в клетках клона-4. Увеличение миграции, приписываемое HGF, было значительным в обеих клеточных линиях, но скорость миграции клеток клона-4 была намного ниже (рис. 1). Инвазия, индуцированная HGF, была более последовательной и более чем на 100% превышала контрольную в обеих клеточных линиях (P <0,05, рисунок 2). Способность ИТК предотвращать такое увеличение была специфична только для дазатиниба. Фактически, дазатиниб не только предотвращал увеличение, вызванное HGF, но и снижал общую инвазию с 205 до 25% от той, которая наблюдалась в клетках, лишенных сыворотки и необработанных (рис. 2).
Рисунок 1
Миграционный анализ. (А) HGF увеличил миграцию в обеих клеточных линиях, но ИТК кризотиниб и дазатиниб смогли подавить миграцию только в клеточной линии COS. *Р ≤ 0,05. Данные представляют из трех независимых экспериментов. (B) Репрезентативные микрофотографии клеток, обработанных HGF ± TKI. Через 24 часа подсчитывали клетки, мигрировавшие в наложенный блок (данные показаны в A).
Рисунок 2
Анализ инвазии. HGF увеличил инвазию в обеих клеточных линиях, и это увеличение предотвращалось дазатинибом, но не кризотинибом. *P ≤ 0,05, в отличие от обработанного HGF. Данные представлены как средние значения ± стандартная ошибка повторяющихся анализов и являются репрезентативными для трех независимых анализов.
Жизнеспособность клеток
Дазатиниб в низкой концентрации, но не кризотиниб, снижал жизнеспособность клеток OS, испытывающих недостаток сыворотки (рис. 3). Этот эффект блокировался HGF в обеих клеточных линиях при концентрациях TKI менее 100 нМ. Защитный эффект HGF терялся при концентрациях дазатиниба более 100 нМ. Кризотиниб был менее эффективен и лишь незначительно ингибировал жизнеспособность клеток COS в концентрациях 100 нМ и выше (рис. 3). Кризотиниб не оказывал влияния на клеточную линию Клон-4 в концентрациях менее 3 мкМ, что было самой высокой концентрацией, которую считали разумной в этом исследовании. Никаких существенных изменений в гибели клеток или апоптозе не было связано с инкубацией дазатиниба с 20 нМ (рис. 4), которая была концентрацией, используемой для анализов миграции и инвазии. В условиях нехватки сыворотки значения IC50 дазатиниба для линии клеток COS составляли 0,1 нМ для необработанных клеток и 32 нМ для обработанных HGF клеток. Дазатиниб был одинаково эффективен в клеточной линии Clone-4: IC50 составлял 0,3 нМ и 112 нМ в необработанных и обработанных клетках соответственно. IC50 кризотиниба для клеток COS составляли 340 нМ и 357 нМ для необработанных и обработанных HGF клеток соответственно; и никаких значений IC50 для кризотиниба не наблюдалось в клетках клона-4, поскольку препарат не снижал эффективно жизнеспособность этих клеток.
Рисунок 3
Анализы MTS с ингибиторами тирозинкиназы и HGF. Жизнеспособность стимулированных HGF клеток ингибировалась в низких концентрациях дазатинибом (верхние панели), но не кризотинибом (нижние панели). *Разница между обработанными HGF и контролем при той же концентрации TKI (P ≤ 0,05). Значения IC50 для дазатиниба составляли 0,1 нМ в контрольной группе и 32 нМ в клетках, инкубированных с HGF в клеточной линии COS. Эти значения составляли 0,3 нМ и 112 нМ в клеточной линии Клон-4 соответственно. Значения IC50 для кризотиниба составляли 340 нМ и 357 для контролей COS и клеток, обработанных HGF, и не были достигнуты в клеточной линии Клон-4.
Рисунок 4
Гибель клеток/апоптоз. (A) Анализ живых/мертвых клеток трипанового синего на клетках COS и клона-4, инкубированных в течение 24 часов в концентрациях дазатиниба от 0 до 40 нМ, не выявил значительного увеличения гибели клеток вследствие обработки ИТК (P > 0,05). Представленные данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение двух независимых экспериментов. (B) Данные проточной цитометрии клеток, инкубированных в течение 24 часов с 20 нМ дазатиниба, не показывают увеличения совокупного уровня ранних апоптотических или поздних апоптотических/некротических клеток (P > 0,05). Представленные данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение двух независимых экспериментов.
МЕТ Фосфорилирование
Фосфорилирование тирозина (pY) MET в клетках, лишенных сыворотки, было строго положительным и, по-видимому, не изменялось под действием HGF (рис. 5). Инкубация TKI также, по-видимому, мало влияла на pY-MET, за исключением того, что дазатиниб был способен снижать, но не устранять этот сигнал активации в клетках клона-4.
Рисунок 5
Активация МЕТ. (А) Вестерн-блоттинг клеток, лишенных сыворотки, показывает, что МЕТ конститутивно активируется в обеих клеточных линиях. Инкубация HGF мало влияла на фосфорилирование MET по тирозинам 1230/1234/1235, а инкубация TKI (20 нМ) была недостаточной, чтобы обратить это вспять. Дазатиниб подавлял, но не устранял сигнал pY-MET в клетках клона-4. (B) Гистограмма денситометрии вестерн-блоттинга pY-MET, показанная на A.
Влияние HGF и ИТК на MMP-2 и MMP-9
В этом исследовании оценивалось влияние HGF на секрецию MMP-2 и MMP-9 линиями клеток ОС и измерялась способность ИТК дазатиниба и кризотиниба блокировать эту секрецию. Мы были удивлены тем, что продукция изоформ ММП резко различалась в двухклеточных линиях ОС. Начиная с MMP-2, секреция проформы MMP-2 резко индуцировалась в клетках COS с помощью среды, содержащей сыворотку; но этого не наблюдалось в клетках клона-4 (рис. 6). Как про-, так и активная формы MMP-2 продуцировались в присутствии HGF в клетках COS, но HGF индуцировал только активную форму в клетках клона-4. Денситометрия зимограммы показывает зависимость «доза-реакция», при этом оба ИТК подавляют секрецию активной формы ММП-2; однако этот эффект был более выражен при приеме дазатиниба (рис. 6). Разница между двумя клеточными линиями была более выраженной при секреции MMP-9 по сравнению с таковой, наблюдаемой в MMP-2, поскольку среда из клеток COS давала основную полосу на зимографах, тогда как при использовании среды из клеточной линии Clone-4 ничего не было обнаружено. В этом отношении секреция ММП-9 полностью зависела от HGF в клетках COS (рис. 7, данные ММП-9 для клона-4 не показаны). Эта HGF-индуцированная секреция MMP-9 подавлялась в клетках COS при совместной инкубации с кризотинибом, но не с дазатинибом. Представленные данные являются репрезентативными для трех независимых экспериментов (рис. 7).
Рисунок 6
Экспрессия и протеазная активность MMP2 в клетках COS и Clone-4, подвергшихся воздействию HGF и кризотиниба или дазатиниба. (А) Клетки инкубировали в течение ночи в среде R10 (10% сыворотки) или бессывороточной среде с HGF ± TKI, как указано. Criz-20 и criz-40 указывают инкубационные концентрации 20 нМ и 40 нМ. Паттерны экспрессии между двумя клеточными линиями совершенно различны: клетки COS одинаково экспрессируют про- и активную форму, тогда как клетки клона-4 экспрессируют только активную форму. Протеазная активность активной MMP2 снижалась как кризотинибом, так и дазатинибом, причем дазатиниб оказался более эффективным препаратом в этих низких концентрациях.
Рисунок 7
Экспрессия и протеазная активность MMP9 в клетках COS, подвергшихся воздействию HGF и кризотиниба или дазатиниба. (А) Зимограмма, показывающая результат двух независимых экспериментов, проведенных на одном и том же геле. (B) Гистограмма денситометрии данных из зимограммы, показанной на A. Столбики ошибок указывают SD.
Клинические корреляты
Мы лечили собак дазатинибом от аппендикулярной ОС с согласия владельца. Это сочеталось с ампутацией конечностей и химиотерапией карбоплатином, которые являются одними из нынешних стандартов лечения ОС у собак. Хотя это и не было клиническим исследованием, мы чувствовали, что важно определить, могут ли наши данные in vitro быть перенесены на больных собак в условиях пилотных данных. Это дало возможность получить опыт в области переносимых доз препарата, разработать протокол для будущих клинических испытаний и начать наблюдения за потенциальной терапевтической ролью дазатиниба у собак с ОС.
Начальная доза дазатиниба для всех собак составляла 0,5 мг/кг, вводившаяся каждый день или через день (таблица 1). При необходимости в дни лечения назначались противорвотные средства перорально (маропитант 2 мг/кг однократно и/или ондансетрон 0,2 мг/кг два-три раза в день). Основными побочными эффектами были отсутствие аппетита и желудочно-кишечные расстройства с диареей. В большинстве случаев это не исключает лечения дазатинибом. Через 2 недели без значительных побочных эффектов доза 0,5 мг/кг была увеличена до 0,75 мг/кг и продолжалась неопределенно долго или до решения владельца прекратить прием. Дозы выше 0,75 мг/кг обычно не переносились. Таблица 1 содержит подробную информацию о сигналах собак, расположении опухоли, лечении и времени выживания. Опухоли двух собак были сопоставлены с группой лекарств, и было предсказано, что дазатиниб будет наиболее эффективным у этих животных. Эти собаки имели самое продолжительное время выживания (Таблица 1). Подробности по золотистому ретриверу ранее были опубликованы в таблице [16]. Все собаки в этом отчете имели крупный рост, что типично для собак и людей, больных ОС. Все развитые ОС локализуются в проксимальном отделе большеберцовой кости, обычном месте возникновения ОС у людей, тогда как у собак наиболее часто встречается дистальная лучевая кость. Гистопатологическое исследование, проведенное сертифицированным ветеринарным патологом, подтвердило диагноз ОС в опухоли каждой собаки. Репрезентативные гистологические срезы OS большеберцовой кости Великих Пиренеев (таблица 1) показаны на рисунке 8 (A и B). Рентгенологическое изображение этой опухоли показано на рисунке 8 (С). В первую очередь это остеолитическая опухоль с разрушением кости в медуллярном пространстве и патологическим переломом кортикального слоя (рис. 8C, нижняя стрелка).
Рисунок 8
Тематические исследования. (А) Гистопатология ОС правой большеберцовой кости из Великих Пиренеев показывает, что костномозговая полость была инвазирована потоками плотно упакованных инфильтрирующих веретенообразных клеток. Эти клетки имели фибриллярную, эозинофильную, нечетко окаймленную цитоплазму, удлиненные ядра с волнистой мембраной, грубый, рассеянный хроматин и множественные ядрышки. (Б) Клетки стали более округлыми (стрелка) вдоль швов остеоида (звездочка), где они оказались в лакунах. Присутствовали многоядерные клетки и 1 митотическая фигура в 10 смежных полях размером 400×. (А) 200 ×, (Б) 400 ×. (C) Рентгенографическое изображение (вид сбоку) большеберцовой кости Великих Пиренеев показывает заметное разрушение кости в костномозговом пространстве, что создает видимость очаговой потери костной массы (верхняя стрелка). Имеет место патологический перелом коры (нижняя стрелка). (D) Рентгенологическое изображение метастазов в легких, которые разрешились через 3 месяца лечения дазатинибом (E). Эта собака остается жива через 33 месяца после постановки диагноза.
Таблица 1
Характеристики пациентов, выживаемость и лечение
| Характеристика | Опухолевая локализация | Время выживания | Лечение дазатинибом |
| Голден ретривер, 7 лет, кастрирован | Левый проксимальный отдел большеберцовой кости | 29 месяцев | 0,5–0,75мг/кг, каждые 24ч, 6,5 месяцев |
| Лабрадор ретривер, 4 года, кастрирован | Левый проксимальный отдел большеберцовой кости | 28 месяцев | 0,5–0,75мг/кг, через день, 10 месяцев |
| Помесь немецкой овчарки, 9 лет, кастрирован | Правый проксимальный отдел большеберцовой кости | 33 месяца (все еще живет) | 0,5–0,75мг/кг, каждые 24ч, 25 месяцев |
| Пиренейская горная собака, 10 лет, кастрирован | Правый проксимальный отдел большеберцовой кости | 15 месяцев | 0,5–0,75мг/кг, через день, 7 месяцев |
Три из четырех собак начали лечение дазатинибом после ампутации конечностей и пяти циклов химиотерапии карбоплатином, проводимых каждые 3 недели в стандартной дозе (300 мг/м2). Лечение дазатинибом началось через 3 недели после завершения химиотерапии. На тот момент у собак не было рентгенологически обнаруживаемых легочных метастазов. Собака, выжившая дольше всех (смесь немецкой овчарки, таблица 1), начала давать дазатиниб, когда после трех из пяти запланированных курсов лечения карбоплатином были обнаружены метастазы в легких. Одиночный легочный узел (1 см) (рис. 8D) разрешился после 3 месяцев лечения дазатинибом (рис. 8E). Эта собака не получала никакой дополнительной химиотерапии карбоплатином, но продолжала принимать дазатиниб в общей сложности 25 месяцев. Таким образом, наши предварительные рентгенологические данные свидетельствуют о том, что дазатиниб стабилизировал или индуцировал частичную ремиссию легочных метастазов как минимум у двух собак.
Наименьшее время выживания у любой из четырех собак, получавших адъювант дазатиниб, было почти в 1,5 раза дольше, чем у собак, отмеченных в исторических отчетах; и одна собака на момент написания этой статьи продолжает жить через 33 месяца после постановки диагноза (> в 3,2 раза дольше, чем сообщаемое медианное время выживания).
Обсуждение
В этом исследовании изучалась роль HGF в ОС собак с использованием модели метастазирования in vitro, поскольку метастазы, а не первичная опухоль, являются причиной смертности при ОС. Мы описываем эффекты ИТК кризотиниба и дазатиниба, используя эту модельную систему, и включаем данные о лечении и выживаемости четырех собак, которым давали дазатиниб в качестве адъювантного лечения ОС.
Изучение метастатического поведения осложняется тем фактом, что некоторые опухолевые клетки могут содержать одну или несколько мутаций, которые запускают как метастазирование, так и антиапоптотические или пролиферативные механизмы. В этом исследовании мы использовали инкубацию TKI с низкой концентрацией ± HGF как способ наблюдать HGF-специфическое поведение клеток в присутствии сублетальных концентраций TKI. Более высокие концентрации ИТК, возможно, имели больший эффект, но казалось невероятным, что умирающие клетки будут проявлять метастатическое поведение. В этом отношении HGF блокировал влияние дазатиниба на жизнеспособность при низких концентрациях препарата, что позволяет предположить, что путь HGF модулирует как жизнеспособность/пролиферацию, так и инвазию в этой модельной системе. Однако отсутствие увеличения гибели клеток или апоптоза в ответ на 20 нМ дазатиниба (рис. 4) позволяет предположить, что дазатиниб оказывает преимущественно антипролиферативное действие при низких концентрациях препарата. В текущем исследовании мы попытались разграничить метастатическое и пролиферативное поведение in vitro; однако тот факт, что инкубация ИТК влияет на несколько физиологических путей, важен, и необходимы дальнейшие исследования, направленные на выяснение этих различий.
HGF увеличил скорость миграции и инвазии в обеих протестированных клеточных линиях. Аналогичным образом, обе клеточные линии, по-видимому, имели конститутивную активацию MET RTK по тирозинам 1230, 1234 и 1235, которые находятся в активирующем киназном домене. Инкубация с кризотинибом низкой концентрации, который, как сообщается, является MET-специфичным ИТК, или дазатинибом не приводила к значительному снижению кажущегося фосфорилирования MET в этих сайтах. Будущие исследования могут принести пользу, определив степень и причину аутофосфорилирования МЕТ при ОС.
Мы были удивлены тем, что кризотиниб, но не дазатиниб, снижал HGF-индуцированную секрецию активной ММП-9 в клеточной линии COS. Более того, не было обнаружено секреции MMP-9 клетками клона-4; тем не менее, клетки, по-видимому, были способны разрушать субстрат камеры инвазии с той же скоростью, что и COS. Мы не оценивали напрямую механизм протеазной активности в системе модели инвазии, но предполагаем, что клетки клона-4 зависят от активности MMP-2, тогда как Клетки COS могут достичь того же результата, используя MMP-9. Тем не менее, настоящие данные впервые показывают, что клетки OS способны секретировать различные формы протеазы, и они могут функционировать, разрушая внеклеточный матрикс и облегчая инвазию.
Наша неспособность продемонстрировать разницу в фосфорилировании MET при активации HGF позволяет предположить, что HGF активировал либо другой RTK, либо другой эпитоп MET. HGF существует в виде гетеродимера альфа- и бета-цепи, который может расщепляться на составные части. Ониши и др. [19] недавно идентифицировали новый рецептор бета-цепи HGF (HGF-β), но этот рецептор не исследовался в текущем исследовании. Дальнейшие исследования необходимы для улучшения нашего понимания механизмов активации HGF при ОС.
Сообщается, что медиана выживаемости собак с аппендикулярной ОС, получавших ампутацию и карбоплатин, составляет примерно 10 месяцев [20,21]. Хотя представленные здесь данные in vivo носят разрозненный характер, мы считаем, что они помогают перейти от исследований дазатиниба in vitro при ОС собак к клиническим условиям. Ранее мы сообщали, что дазатиниб в дозе 0,75 мг/кг в день переносим и позволяет достичь клинически значимого уровня препарата в крови [16]. Теперь мы расширили это исследование, включив в него еще трех собак, выживаемость которых, по всей видимости, улучшилась. Одна выжившая собака, о которой сообщается здесь, прожила более чем в 3,2 раза дольше, чем заявленное среднее время выживания. Большую часть этого времени эта собака жила с растущими и уменьшающимися метастазами в легких. Судя по всему, дазатиниб сыграл свою роль в этом долголетии. Хотя изначально дазатиниб разрабатывался как ингибитор Src, теперь известно, что он влияет на несколько киназ, каждая из которых имеет широкий спектр функций. В связи с этим дазатиниб исследовали на предмет его способности снижать пермиссивные эффекты Т-регуляторных иммунных клеток в микроокружении опухоли [22–24]. Мы предполагаем, что это может быть важно для ОС у собак, и считаем, что текущие наблюдения в сочетании с приемлемой дозой и графиком введения дазатиниба обеспечивают основу для клинических исследований на собаках с ОС.